冰片和薄荷醇通過P糖蛋白對藥物經(jīng)皮吸收的研究.pdf

1、目的:從整體和細胞水平探討冰片和薄荷醇對皮膚內P糖蛋白（P-gp）的影響。研究P-gp轉運功能與藥物經(jīng)皮吸收效果的關系，探討P-gp在經(jīng)皮給藥研究中的潛在價值；并進一步深入研究冰片、薄荷醇的促透機制，為促透劑的應用與開發(fā)提供依據(jù)。
　　方法：1.免疫組化實驗
　　選用小鼠背部皮膚，采用免疫組化SABC法，鏡下觀察染色的分布。
　　2.體外皮膚滲透性實驗
　　采用雙室透皮裝置，選用小鼠背部皮膚，通過測定羅丹明123

2、（Rh123）與熒光素鈉的累積滲透量，比較透皮吸收的效果。
　　3.MTT藥物濃度篩選實驗
　　采用MTT法對細胞模型進行毒性實驗，使用酶標儀測定OD值，計算細胞存活率。
　　4.細胞免疫熒光實驗
　　體外培養(yǎng)人微血管內皮細胞（HDMEC），采用細胞免疫熒光技術檢測HDMEC中P-gp的表達。實驗分組為空白組、DMSO組、冰片組、薄荷醇組。
　　5.逆轉錄PCR(RT-PCR)實驗
　　體外培養(yǎng)HDM

3、EC，實驗細胞分為空白組，62.5μM、125μM、250μM、500μM冰片組、62.5μM、125μM、250μM、500μM薄荷醇組。采用RT-PCR技術檢測MDR1mRNA的表達。
　　6.蛋白質印跡法(Western-blot)實驗
　　體外培養(yǎng)HDMEC，實驗細胞分為空白組，62.5μM、125μM、250μM、500μM冰片組，62.5μM、125μM、250μM、500μM薄荷醇組。采用Western-blo

4、t技術檢測P-gp的表達。
　　7.細胞底物積累外排實驗
　　體外培養(yǎng)HDMEC，實驗細胞分為空白組，維拉帕米陽性對照組、62.5μM、125μM、250μM、500μM冰片組，62.5μM、125μM、250μM、500μM薄荷醇組。采用細胞免疫熒光技術，半定量細胞積累及外排后的熒光強度。
　　8.離體皮膚滲透性實驗
　　采用雙室透皮裝置，選用小鼠背部皮膚，測定添加了高、中、低濃度冰片、薄荷醇的Rh123與熒光

5、素鈉的累積滲透量，維拉帕米作為陽性對照藥物。
　　9.在體皮膚滲透性實驗
　　選用小鼠在體透皮給藥，設置空白組、冰片組以及薄荷醇組。取組織勻漿液樣本，采用高效液相（HPLC）測定Rh123滲透量。
　　結果：1.P-gp在皮膚中的分布與表達
　　小鼠皮膚表皮、真皮以及皮下組織中均有明顯DAB棕色染色。
　　2.P-gp在皮膚中的功能作用
　　體外離體透皮實驗結果顯示，Rh123累積滲透量明顯多于熒光素

6、鈉（p<0.01）,維拉帕米+Rh123組透過量較Rh123組累積滲透量顯著增多（p<0.01），維拉帕米+熒光素鈉組與熒光素鈉組的累積滲透量無顯著性差異（p>0.05）。
　　3.冰片、薄荷醇給藥濃度的確定
　　MTT細胞毒性實驗顯示，冰片給藥濃度不高于500μM時，HDMEC細胞活性>80％，薄荷醇給藥濃度不高于600μM時，HDMEC細胞活性>80%，陽性對照藥物維拉帕米給藥濃度不高于30μM時，HDMEC細胞活性>8

7、0%。
　　4.P-gp在HDMEC中的表達及冰片、薄荷醇對其表達的影響
　　細胞免疫熒光結果顯示，HDMEC有明顯綠色熒光。與空白組相比，冰片組HDMEC的熒光強度較弱，薄荷醇組較強。
　　5.冰片、薄荷醇對MDR1mRNA表達的影響
　　冰片、薄荷醇給藥孵育48h后，冰片組HDMEC中MDR1mRNA的表達量與空白組相比顯著減少（p<0.01）；薄荷醇組MDR1mRNA的表達量隨薄荷醇濃度的升高而增高，與空白

8、組相比顯著增加（p<0.01）。
　　6.冰片、薄荷醇對P-gp表達的影響
　　冰片、薄荷醇給藥孵育48h后，與空白組相比，冰片50μM組 HDMEC中P-gp的表達量無明顯變化（P>0.05），其余冰片組顯著減少（p<0.01）；與空白組相比，薄荷醇組P-gp的表達量顯著增加（p<0.01）。
　　7.冰片、薄荷醇對P-gp功能的影響
　　細胞免疫熒光實驗結果顯示，HDMEC中Rh123的積累量隨冰片給藥濃度的

9、升高而增大（p<0.01），隨薄荷醇給藥濃度的升高而減少（p<0.01）。冰片組HDMEC中Rh123的外排量顯著增加（p<0.01），Rh123的外排量隨薄荷醇濃度的升高無明顯變化，但均高于空白組（p<0.01）。
　　8.冰片、薄荷醇通過P-gp對藥物經(jīng)皮吸收的影響
　　體外離體透皮實驗結果顯示，薄荷醇組 Rh123累積滲透量明顯多于熒光素鈉（p<0.01）,冰片組Rh123累積滲透量明顯少于熒光素鈉（p<0.01）,薄

10、荷醇組Rh123累積滲透量明顯多于冰片組（p<0.01）。
　　9.在體皮膚滲透性實驗
　　高效液相儀檢測組織勻漿上清液樣本，樣品濃度均在檢測限以下，無檢測結果。
　　結論：1.P-gp在皮膚中有明顯分布與表達。
　　2.皮膚中P-gp可促進其底物的經(jīng)皮吸收，對非底物的經(jīng)皮吸收影響不顯著。
　　3.冰片可抑制HDMEC中MDR1mRNA及P-gp的表達，薄荷醇對HDMEC中MDR1 mRNA及P-gp的表達