基于氧化石墨烯和納米金的高靈敏度免疫檢測新方法研究.pdf

1、蛋白質組學研究的核心技術是規(guī)?；l(fā)現和高通量驗證,目前依賴于質譜技術的規(guī)?；l(fā)現技術已獲得到較快的發(fā)展,但是藉此確定的目標蛋白質的準確驗證仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的課題。現有的驗證方法主要是基于質譜的多反應監(jiān)測質譜方法(multiple reaction monitoring,MRM)和基于抗體的免疫檢測方法。MRM方法雖然具有較好的規(guī)?；芰?但是其靈敏度較低,因而其應用受到限制,所以免疫檢測方法仍是目前首選的方法。免疫檢測方法的靈敏度相

2、對較高,但是該方法需要依賴昂貴的抗體,且對于低豐度蛋白質,其靈敏度仍不能滿足要求,迫切需要新的靈敏度高、價格低廉的免疫檢測方法。
　　針對以上問題,本研究將納米金(GNP)和氧化石墨烯(GO)引入到目前常用的免疫檢測方法,即蛋白質免疫印跡(western blotting)和酶聯(lián)免疫吸附實驗法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)中,發(fā)展了新的免疫檢測方法。其主要原理是基于這兩種納米載體

3、擁有大的比表面積,可以逐級放大檢測信號,同時雙一抗的引入和增大辣根過氧化物酶(HRP)與二抗的比例等,在提高靈敏度的同時,大大降低了成本。
　　基于以上原理,發(fā)展了新的免疫檢測方法,包括:基于氧化石墨烯和納米金的信號雙重放大western blotting新方法和基于氧化石墨烯和納米金的信號三重放大ELISA新方法。
　　在基于氧化石墨烯和納米金的信號雙重放大western blotting新方法的研究中,同時引入了納米金和

4、氧化石墨烯。首先用納米金與一抗結合,使得一定量的抗原能夠間接地與更多的一抗相結合,擴大了一抗與抗原的比例。然后用氧化石墨烯與二抗結合,使得一定量的一抗能夠結合更多的二抗,增大了二抗與一抗的比例。通過兩次比例的擴增,信號得到逐級放大,檢測限被大大降低。而在納米金與一抗結合過程中,同時引入兩種一抗(與抗原對應的特異性一抗和輔助一抗),由于輔助一抗在價格上比特異性一抗更低廉,所以通過該步驟操作,在放大信號的同時,使昂貴的特異性一抗成本大大降低

5、。western blotting新方法的優(yōu)點是在檢測信號進行雙重放大的同時使得成本大大降低,拓寬了傳統(tǒng)western blotting方法的應用范圍,增強了檢測能力。實驗結果表明,改進后的western blotting和傳統(tǒng)Western blotting方法對GST蛋白質的檢測限分別為2ngmL-1和64ngmL-1,新方法的檢測限降低了32倍,成本也大大降低。而且多次重復實驗結果表明,該方法穩(wěn)定性好。
　　在基于氧化石墨烯

6、和納米金的信號三重放大ELISA新方法的研究中,分三次先后引入了納米金、氧化石墨烯和納米金。首先將納米金與雙一抗按一定比例結合,通過此步操作,實現信號的第一次放大和成本的第一次降低;其次,通過納米金與二抗和高比例的HRP結合(此處加入的HRP與二抗的比例是100:1),實現信號的第二次放大和成本的第二次降低。最后,將氧化石墨烯與第二步中制備的中間體結合,擴大了二抗與一抗的結合比例,達到了再次放大信號的目的。這種依次將納米金、氧化石墨烯和