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文檔簡介
1、目的:通過氯化鈷(CoCl2)誘導人臍靜脈內皮細胞(humen umbilical veinendothelial cell,HUVEC)建立化學缺氧模型,觀察缺氧內皮細胞的血管形成情況,以及應用白藜三醇(Resveratrol,Res)后HIF-1α、VEGF、p-Akt的蛋白變化,探討Res對缺氧的HUVEC的血管生成作用的影響及可能機制,為Res治療心血管疾病提供新的理論依據(jù)。
方法:通過100μmol/L氯化鈷建立化學
2、缺氧模型,體外培養(yǎng)HUVEC(1)實驗分五組:高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)組(對照組)、CoCl2誘導細胞缺氧組(缺氧組)、缺氧+LY294002組(阻斷劑組)、缺氧+Res組(藥物組)、缺氧+Res+LY294002組(藥物阻斷劑組)。Res預孵育2h,LY29400210μmol/L預孵育1h。
(2)采用CCK-8法檢測細胞增殖情況;
(3)采用蛋白免疫印跡(western blot)檢測低氧誘導因子(HIF-1α)
3、、血管內皮生長因子(VEGF)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白的表達;
(4)采用免疫細胞化學的方法檢測低氧誘導因子(HIF-1α)的蛋白表達;
(5)采用transwell chamber檢測內皮細胞的遷移能力;
(6)小管形成實驗檢測內皮細胞的體外血管形成能力。
結果:(1) CCK8:缺氧組與正常組相比細胞增殖增加(P<0.01);藥物組(0.1,1,5,10,50
4、μmol/L)與正常組相比細胞增殖增加(P<0.01);藥物組(1,5μmol/L)與缺氧組比細胞增殖增加(P<0.01)。尤其藥物組5μmol/L細胞增殖明顯增加(P<0.01);藥物組(0.1,10μmol/L)與缺氧組相比無明顯統(tǒng)計學意義。藥物組(50μmol/L)與其他各組相比細胞數(shù)明顯減少(P<0.01)。
(2) Western blot:與對照組比較,缺氧組HIF-1α(P<0.05)、VEGF(P<0.05)、
5、p-Akt(P<0.05)蛋白表達增加;與缺氧組比較,阻斷劑組HIF-1α(P<0.05)、VEGF(P<0.05)、p-Akt(P<0.05)蛋白表達減低,藥物組HIF-1α(P<0.01)、VEGF(P<0.01)、p-Akt(P<0.01)蛋白表達增加;與阻斷劑組比較,藥物阻斷劑組HIF-1α、VEGF、p-Akt變化無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
(3)免疫細胞化學:缺氧組:胞內HIF-1α陽性表達,顯色呈黃褐色;
6、阻斷劑組:胞內HIF-1α表達減弱,顯色呈淺黃棕色;藥物組(選取Res為5μmol/L):胞內HIF-1α強陽性表達,顯色呈深黃褐色;藥物阻斷劑組:胞內HIF-1α表達較藥物組減弱,呈淺黃褐色。
(4) transwell chamber:藥物組內皮細胞遷移率大于缺氧組(P<0.01),阻斷劑組內皮細胞遷移率小于缺氧組(P<0.01)。
(5)小管形成實驗:藥物組在體外的血管形成數(shù)量明顯大于缺氧組(P<0.01)。阻
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