菊粉內切酶基因克隆、表達及菊寡糖中試設計.pdf

1、菊粉是一種天然果聚糖，菊粉內切酶能夠水解菊粉生成低聚果糖，低聚果糖是一種功能性食品添加劑，其保健作用體現在能夠降低血糖水平，促進人體和動物腸道的微生態(tài)平衡和提高免疫力等等。利用微生物菊粉內切酶可以一步法水解菊粉獲得高達80％的低聚果糖，但是只有少數微生物產菊粉內切酶，并且產酶量極低，從而造成分離純化困難，制約低聚果糖工業(yè)的發(fā)展。本研究的主要目的就是構建菊粉內切酶的工程酵母來高效表達菊粉內切酶，為解決目前低聚果糖生產中的問題提供有效的解決

2、途徑。 本研究以黑曲霉9891的基因組DNA為模板進行PCR擴增獲得了編碼菊粉內切酶的基因，并將它克隆進表達載體pPIC9，經過酶切、PCR和測序驗證后，將重組表達載體pPIC9-Endoinu經BglⅡ酶切線性化后電轉化到PichiapastorisGS115中。重組子通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基進行篩選。重組菊粉內切酶在PichiapastorisGS115中實現了表達并在7L發(fā)酵罐中對其進行了優(yōu)化表達研究，蛋白分泌量達2.15mg

3、/ml。表達產物的SDS-PAGE分析表明，蛋白質分子量大小約為59KD。菊粉內切酶的活性測定結果為1501U/ml(以蔗糖為底物)和291U/ml(以菊粉為底物)，同原始供體菌株相比，分別高105倍和273倍，通過酶學特性研究顯示該酶反應最適pH為5.6，最適溫度是55℃。同時還對菊粉內切酶的高級結構進行了模擬，得到了該蛋白的高級結構的初步信息。根據SDS-PAGE電泳和酶的功能性分析，證明目的蛋白已在Pichiapastoris中成