RNA干擾對HCMV引起平滑肌細胞損傷的保護作用研究.pdf

1、目的： 動脈粥樣硬化(AtheroscleFOSis，AS)嚴重威脅人類健康，是發(fā)達國家人口死亡的主要原因，在我國AS的發(fā)病率也呈逐年增高的趨勢。研究證明血管炎癥反應在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中起關鍵作用。血清流行病學和分子生物學的研究資料表明，人類巨細胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)抗原及其DNA序列存在于AS的病灶組織，主要見于血管平滑肌細胞(vascular Smooth Musclecel

2、ls，VSMC)和內皮細胞(vein erldothelial cell，ECV)，且AS患者血清HCMV的抗體陽性率明顯增高，提示HCMV的感染對AS的形成和發(fā)生發(fā)展起重要作用。迄今為止，對于HCMV如何參與AS的發(fā)病機制尚缺乏深入的了解，研究體外情況下HCMV感染后血管壁細胞的生物學效應，對闡明HCMV致AS機理具有非常重要的意義；VSMC表達的氧化型低密度脂蛋白受體-1(Lectin-like oxidized low densi

3、tv lipoprotein receptor-1，L,OX-1)是氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OX-LDL)最重要的受體之一，也是VSMC結合或者內吞OX-LDL的最重要受體之一，該受體還可誘導單核巨噬細胞轉運到血管內膜下間隙，刺激平滑肌細胞增生并釋放多種炎性細胞因子，同時VSMC內吞OX-LDL轉化成泡沫細胞。外周血單核細胞粘附于內皮并遷入內皮下間隙，攝取脂質轉化為泡沫細胞是

4、動脈粥樣硬化形成的重要早期事件，單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoatt ractant protein-1，MCP-1)在這一過程中起重要作用；MCP-1還可通過促進VSMC增殖，參與AS的病理過程。 本課題通過構建siRNA質粒，調節(jié)HCMV誘導兔血管平滑肌細胞LOX-1、MCP-1表達以及HCMV的復制，觀察siRNA質粒是否對LOX-1、MCP-1表達以及ItCMV復制有抑制作用，從而明確HCMV通過上

5、調LOX-1和MCP-1表達參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的機制，探討siRNA在HCMV感染加劇動脈粥樣硬化發(fā)病機制中的可能治療作用。 方法： 1．設計和構建RNA干擾質粒設計靶基因，采用化學合成法獲得目的基因，將目的基因ORF與odsRED2-N1質粒連接后成RFP融合蛋白表達載體，進行RNAi有效靶點篩選后用293T細胞進行慢病毒包裝獲得rabLOX-1質粒。 2. 兔主動脈平滑肌細胞培養(yǎng)將血管中膜的內中層進行組

6、織塊培養(yǎng)并鑒定，待細胞呈亞單層狀態(tài)，按常規(guī)方法進行傳代，第3-8代細胞用于實驗。 3. 基因轉染 實驗分為五組：正常細胞對照組：用含2﹪血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)VSMC細胞；rabLOX-1組：按100MOI濃度接種慢病毒質粒rabLOX-1，37℃吸附2h后，棄病毒液，用含2﹪血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞；HCMV感染組：以100TCID<,50>/0.1ml濃度接種HCMV ADl69病毒株于70-80﹪融合的VSMC，37℃吸

7、附1h后，棄病毒液，用含2﹪血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞；HCMV+rabLOX-1組：按100TCID<,50>/0.1ml濃度接種HCMVADl69病毒株于VSMC單層細胞，再按100MOI濃度接種慢病毒質粒rabLOX-1，用含2﹪血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞；HCMV+空載體組：按100TCID<,50>/0.1ml濃度接種HCMVADl69病毒株于VSMC單層細胞，再按100MOI濃度接種慢病毒空載體，用含2﹪血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。

8、 4. 反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測LOX-1mRNA、MCP-lmRNA和HCMVIE72mRNA表達變化用Trizol提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，：PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結果并拍照、掃描。將凝膠電泳圖條帶密度進行計算機分析，計算電泳條帶與GAPDH擴增條帶光密度值作為其相對表達強度。 5. 蛋白印記法(Western blotting)測LOX-1蛋白表達收集細胞提取總蛋白并

9、測蛋白濃度后，電泳轉膜后，進行免疫反應，避光顯色至出現條帶并進行軟件分析。 結果： 1. 經測序及酶切鑒定證明成功構建了慢病毒包裝的rabLOX-1； 2. 免疫組織化學證實平滑肌細胞原代培養(yǎng)成功； 3. RT-PCR結果顯示：HCMV+rabLOX-1組中LOX-1mRNA有低水平表達，與正常細胞對照組和rabLOX-1組差異不明顯，在HCMV組和空載體組表達明顯增強(P<0.01)；MCP-1m

10、RNA在正常細胞對照組和rabLOX-1組表達水平較低，在HCMV組和HCMV+空載體組表達明顯增強，與HCMV+rabLOX-1組、正常細胞對照組及rabLOX-1組均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；HCMV IE72mRNA在HCMV組明顯高于HCMV+rabLOX-1組。提示siRNA質粒可以有效抑制HCMV引起的平滑肌細胞LOX-1和MCP-1上調表達效應，抑制病毒自身在細胞內的復制。 4. Western blotti