抗HBV藥物的分子藥效學評價模型以及減少HBV耐藥的策略研究.pdf

1、CccDNA（covalently closed circular DNA）是乙肝病毒（hepatitis B virus）建立以及維持感染的分子基礎，并在停藥反彈和核苷類藥物（nucleotide or nucleosideanologues，NAs）耐藥產生方面扮演著關鍵角色。針對cccDNA增殖機制開發(fā)新型抗病毒藥物，或者在現有條件下開發(fā)新的治療策略來阻止肝臟細胞內cccDNA分子的形成以及降低cccDNA庫是乙肝防治的核心課題之

2、一。
　　 CccDNA增殖過程幾乎涉及到整個HBV DNA復制環(huán)節(jié)，那么臨床常用藥物在哪個環(huán)節(jié)抑制cccDNA增殖，有沒有主要的作用環(huán)節(jié)?對于臨床耐藥率低的NAs有沒有特征性的抑制cccDNA增殖的藥效規(guī)律?深入研究這些問題不僅有助于解釋臨床耐藥現象，更有助于發(fā)現強效抑制cccDNA增殖的藥物，甚至為聯(lián)合治療提供新的研究和評價方法。針對上述問題，本課題采用了臨床抗HBV藥物作為“小分子藥物探針”的研究策略。
　　 氧化

3、苦參堿（OMTR）、膦甲酸鈉（PFA）、拉米夫定（3TC）、阿德福韋酯（ADV）和恩替卡韋（ETV）是5種分子結構不同的小分子化合物，在臨床上均有明確的抗HBV作用。它們分別屬于不同靶點、不同靶位或者同靶位但不同結合方式的藥物。OMTR通過降低宿主蛋白HSC70 mRNA的穩(wěn)定性來抑制HBV復制，PFA作用于HBV復制酶焦磷酸結合的位點；3TC、ADV和ETV三種藥物都以病毒復制酶為靶點但結合模式不同。基于這些化合物對HBV復制過程不同

4、機制的干預，有可能通過針對性的研究揭示出它們各自抑制cccDNA增殖的藥效規(guī)律。
　　 因此本課題主要的研究目的是通過對藥物抑制cccDNA增殖機制的研究，尋求增強抗HBV藥效以及克服乙肝臨床耐藥的策略。
　　 本課題建立了一系列qPCR（real-time quantitative PCR，qPCR），用于檢測HBV不對稱復制過程中主要的復制步驟，即負鏈、正鏈復制和cccDNA的合成。在傳代HepG2.2.15細胞（整

5、合有HBV全基因組的穩(wěn)定轉染細胞系）內，cccDNA增殖是HBV復制周期中主要的分子事件，HBV包膜蛋白的負反饋調節(jié)機制對cccDNA增殖過程影響有限，在此時段內cccDNA自然增殖途徑相對“簡化”，便于研究藥物作用機制?；谏鲜鰲l件，本課題提出“抗HBV藥物的分子藥效學評價模型”。該模型基于對HBV主要復制步驟定量地檢測，在cccDNA增殖期研究藥物作用機制，結合藥效動力學和偏相關性分析可以綜合地評價藥物作用后負鏈、正鏈等復制步驟在c

6、ccDNA增殖過程中的主次作用，從而判斷藥物抑制cccDNA增殖的分子藥理學機制。因此本模型是一個多層次的研究體系，將特異性HBV不對稱復制機制融入到HBV藥效學研究中，用于研究藥物在HBV整個復制周期中主要的分子藥效學機制。
　　 3TC、ADV和ETV三種NAs作用于HepG2.2.15細胞后，可以有效地抑制cccDNA的增殖。因為HBsAg生物學意義和cccDNA相近，本課題對HBsAg胞外分泌水平進行了測量。結果顯示HB

7、sAg可以定量、定性地反映NAs作用后cccDNA降低的趨勢。
　　 通過對HBV正、負鏈復制以及cccDNA增殖抑制的劑量-藥效曲線整體性地分析，以及結合藥效動力學和統(tǒng)計學偏相關分析等方法的數據，結果表明NAs通過不同的分子藥效學機制來抑制cccDNA的增殖。3TC、ETV和ADV三種藥物可能分別主要在負鏈復制、正鏈復制和正鏈補全階段發(fā)揮抑制cccDNA增殖的藥效。其中ETV和ADV的藥效學機制進一步得到其它數據的證實。

8、>　　 本室前期工作通過系列實驗證實OMTR可降低HSC70 mRNA的穩(wěn)定性，而HSC70在HBV逆轉錄過程發(fā)揮輔助復制的作用，因此OMTR通過降低HSC70的豐度來抑制HBV復制。本課題進一步發(fā)現HSC70蛋白CC區(qū)（與底物蛋白結合的功能域）與輔助HBV復制功能密切相關。通過qPCR體系檢測OMTR對HBV正、負鏈以及cccDNA的影響，發(fā)現OMTR同等水平地抑制HBV正、負鏈復制以及cccDNA的增殖，與NAs抑制模式有很大的不

9、同。結合以往研究的結果，OMTR可能主要通過下調負鏈復制水平來抑制cccDNA的增殖。
　　 PFA抗病毒的藥效較弱，在1667μM的劑量時才出現對HBV復制比較明顯的抑制作用。PFA抑制HBV正、負鏈復制以及cccDNA增殖藥效大小的順序為負鏈<正鏈　　 本課題進一步評價了3TC、ADV和ETV三種NAs聯(lián)合治療的藥效。數據表明，

10、所有六種NAs聯(lián)合方案在降低細胞內HBV負鏈復制上表現為協(xié)同或疊加作用。在六種聯(lián)合方案中，僅3TC和ADV相互聯(lián)合的兩種方案在HBV正、負鏈復制，以及cccDNA增殖多個層次上表現為協(xié)同抑制作用，與臨床結果相吻合。以細胞外HBV DNA作為評價指標，結果顯示六種NAs聯(lián)合方案對細胞外HBV DNA水平沒有影響。
　　 總之，“抗HBV藥物的分子藥效學評價模型”具有潛在的理論價值，適用于研究藥物抑制HBV cccDNA增殖的分子藥