攜抗基質金屬蛋白酶-9抗體脂質微泡在評價兔睪丸缺血-再灌注損傷中的研究.pdf

1、目的：探討基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）在兔睪丸中度缺血/再灌注損傷中（IRI）的變化，研制一種具有靶向結合能力的新型脂質微泡，評價靶向微泡在兔睪丸中度缺血/再灌注損傷中的價值。
　　方法：第一部分：12只成年健康大白兔隨機分成：對照組（假手術組/S組），中度缺血再灌注組（IRI組），每組6只。S組隨機暴露一側精索，6h后取暴露側睪丸，福爾馬林固定24h后行HE及免疫組化染色。IRI組隨機選擇一側睪丸進行扭轉手術，將術側睪丸完全

2、阻斷4h后解除結扎，再灌注2 h后取術側睪丸，福爾馬林固定24h后行HE及免疫組化染色。在光學顯微鏡下觀察MMP-9在睪丸中的分布，采用image-proplus6.0 Ver圖像處理系統(tǒng)半定量分析MMP-9的平均光密度。
　　第二部分：制備普通脂質微泡和靶向脂質微泡將各種相關脂質材料按一定比例溶解于適量蒸餾水中，交替使用60℃水浴和超聲波振蕩至分散完全，通六氟化硫（SF6）氣體，機械振蕩至形成乳白色液體即制備好普通脂質微泡或生物

3、素化脂質微泡。生物素化脂質微泡冰上靜置棄下清液純化后，按一定比例加入親和素，繼續(xù)冰上靜置，棄下清液純化后，按一定比例加入生物素化的抗 MMP-9抗體，冰箱4℃保存?zhèn)溆?。采用血細胞計?shù)儀測量普通微泡和靶向微泡的粒徑及濃度。采用 FITC標記的二抗與攜 MMP-9抗體微泡結合，熒光顯微鏡下觀察抗 MMP-9抗體與微泡的連接情況。
　　第三部分：18只健康大白兔隨機分成3組：對照組（假手術組/S組）、中度缺血再灌注未爆破組（IRI-1組

4、）、中度缺血再灌組爆破組（IRI-2組），每組6只。S組隨機暴露一側精索，6h后行普通脂質微泡（MB）和攜抗基質金屬蛋白酶-9抗體脂質微泡（TMB9）的雙側睪丸造影。IRI-1組隨機選擇一側睪丸進行扭轉手術，將術側睪丸完全阻斷4h，再灌注2h后行MB和 TMB9的雙側睪丸造影，實驗結束后處死實驗兔，取術側睪丸，福爾馬林固定24h后行HE染色和免疫組化染色。IRI-2組隨機選擇一側睪丸進行扭轉手術，將術側睪丸完全阻斷4 h，再灌注2h后，

5、首先經耳緣靜脈團注M B，結合高頻高能量超聲觸發(fā)顯像增強微血管通透性，20min后睪丸行TMB9造影。記錄缺血再灌注睪丸及正常睪丸顯影圖像，全部聲學造影圖像存于機內，以備脫機分析。采用專業(yè)超聲軟件分析造影圖像，評價實驗兔睪丸顯影的曲率（S lope）、達峰時間(Tp）、峰值強度（PI）、降半時間（DT/2）、平均渡越時間（MTT）及曲線下面積（AUC）。同時在光學顯微鏡下觀察IRI-1組的MMP-9在睪丸中的分布，采用image-pro

6、plus6.0 Ver圖像處理系統(tǒng)半定量分析MMP-9的平均光密度。使用 SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)均以χ±s表示，組間數(shù)據(jù)的兩兩比較采用單因素方差分析，差異性檢驗水準設為p<0.05。
　　結果：第一部分對照組睪丸光學顯微鏡下HE染色顯示睪丸大部分血管及生精小管基膜完整，各級生精細胞排列整齊有序，精子數(shù)目眾多，間質無明顯充血、水腫，未見明顯中性粒細胞。免疫組化結果示血管內、血管基膜及睪丸間質均未見明顯基質金屬蛋

7、白酶-9表達。IRI組睪丸光學顯微鏡下H E染色顯示睪丸組織大部分生精小管基膜及血管的不完整，部分生精上皮層次減少，成熟分化障礙，部分管腔被大量壞死脫落的細胞充填，間質可見明顯充血及白細胞浸潤，免疫組化示血管基底膜及間質可見明顯的MMP-9表達。術側MMP-9平均光密度值為0.124±0.034。
　　第二部分 MB及TM B9肉眼觀外觀呈白色懸濁液，光學顯微鏡下均呈圓形，完整，分布均勻，粒徑約1.5mm~4mm，微泡濃度均約4.

8、8×108個/ml，熒光顯微鏡下MB未見明顯熒光，TMB9可見明顯綠色熒光圍繞。
　　第三部分對照組MB與TMB9超聲造影均表現(xiàn)為睪丸包膜下先增強，接著睪丸實質開始均勻的增強，達到峰值強度后，再緩慢消退，雙側睪丸超聲造影時間-強度曲線基本一致，MB組的造影參數(shù)（Slope、TP、PI、DT/2、MTT及AUC）較TM B9組無明顯統(tǒng)計學意義（P>0.05）；IRI-1組的M B組和 TM B9組的睪丸超聲造影均表現(xiàn)為術側睪丸實質較

9、正常側增強速度更快，迅速達到峰值強度，且強度顯著增高，再緩慢消退，術側時間-強度曲線較健側峰值明顯升高、前移且下降延遲，呈現(xiàn)“快進慢退”現(xiàn)象，術側睪丸造影時間-強度曲線顯示TM B9組較MB組的達峰時間前移，峰值升高、下降延遲且平均造影時間長，均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IRI-2組術側睪丸TMB9造影表現(xiàn)與IRI-1組類似，兩組造影參數(shù)差別無明顯統(tǒng)計學意義（P>0.05）。IRI-1組術側睪丸的MMP-9平均光密度值為0.080±

10、0.014，較TMB9造影前睪丸的MMP-9平均光密度值差別有計學意義（P<0.05）.
　　結論：1、兔睪丸中度IRI時睪丸血管基底膜及間質可見明顯的MMP-9表達，而正常兔睪丸血管基底膜及間質未見明顯MMP-9的表達；2、成功制備了普通脂質微泡、生物素化脂質微泡和攜抗MMP-9單抗靶向超聲微泡；3、與MB組相比， TMB9組在中度IRI的睪丸中滯留時間長、濃度高；4、當微泡被高能量超聲破壞時，其瞬時所產生的“聲空化”效應并不能