siRNA分子干擾銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵MexB基因表達的效應研究.pdf

1、目的: MexAB-OprM外排泵系統在銅綠假單胞菌多重耐藥中起著重要的作用,本研究旨在探討 RNA分子干擾銅綠假單胞菌 MexAB-OprM外排泵 MexB基因效應的研究;觀察銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)野生株和MexAB-OprM外排泵變異菌株對小鼠致病性的差異。
　　方法:設計并合成2條21bp小分子干擾RNA( small interfering RNA, siRNA)序列,構建干擾R

2、NA表達載體,將帶有siRNA質粒電轉入PAO1。應用E-test方法檢測PAO1抗生素MIC的變化;RT-PCR檢測MexB的mRNA的表達變化。建立銅綠假單胞菌小鼠肺部感染的模型觀察siRNA干擾MexB基因的效應,分別于感染后1d,2d和3d給小鼠腹腔注射美羅培南(meropenem100mg/kg,2次/d)。觀察各組小鼠肺大體和鏡下病理改變情況,細菌計數,檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白介素-1b(IL-1b)和白介素-1

3、2(IL一12)表達水平,并檢測肺組織髓過氧化物酶(MPO)表達水平。同時建立銅綠假單胞菌野生株K767,銅綠假單胞菌變異株nalB和△mexB小鼠肺部感染模型,并于感染后1,2和3d應用美羅培南(meropenem100mg/kg,2次/d)治療小鼠,治療后第3d,7d,14d進行各組小鼠各項指標觀察。
　　結果: MIC結果顯示siRNA能明顯提高PAO1對抗生素的敏感性。RT-PCR結果顯示siRNA干擾后的PAO1MexB

4、基因表達明顯下降(p<0.05)。siRNA干擾組小鼠,感染后3d,5d,7d肺部細菌負荷明顯下降。相對于siRNAnon(PAO1)組和Scrambled siRNA(陰性分子對照)組, siRNA組小鼠具有明顯減輕的病理學改變。在感染早期(3d)siRNA干擾組,中性粒細胞的募集(MPO)和炎性細胞因子(IL-1b和IL-12)升高,在感染后期(7d)表達水平下降。MexAB-OprM外排泵變異小鼠感染模型的結果顯示,相比于K767

5、和nalB組,在感染早期(3d),△mexB組中性粒細胞的募集(MPO)升高,在感染后期(14d)炎性細胞因子表達水平下降。各組血清巨噬細胞炎癥蛋白-2(MIP-2)的水平在感染期間均持續(xù)升高,△mexB組與K767和nalB組相比,組間差異顯著,p<0.05?！鱩exB組細菌載量在感染后7,14d下降明顯,同時△mexB組具有明顯減輕的病理學改變。與K767和nalB組相比,在感染早期(3d),△mexB組中性粒細胞的募集(MPO)和

6、炎性細胞因子(IL-1b, IL-12和TNF-a)水平明顯升高,在感染后期(14d), MPO和細胞因子表達水平明顯下降。三組血清巨噬細胞炎癥蛋白-2(MIP-2)的水平在感染期間均持續(xù)升高,△mexB組與K767和nalB組相比,組間差異顯著,p<0.05。
　　結論:siRNA可以同時抑制MexAB-OprM外排泵MexB基因的表達和銅綠假單胞菌在體外的活動。體內研究顯示,siRNA能有效減少小鼠慢性肺部感染的細菌載量,以M

7、exB為靶基因設計的siRNA分子為治療銅綠假單胞菌慢性感染的提供新方法。本研究為慢性銅綠假單胞菌肺部感染的治療提供了新的思路。此外,MexAB-OprM外排泵缺陷菌株△mexB組的肺部病變明顯輕于nalB組,表明MexAB-OprM外排泵系統在銅綠假單胞菌慢性肺部感染發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。
　　本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 siRNA干擾銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵mexB基因表達的體外研究<

8、br>　　目的:探討siRNA分子對銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵mexB基因表達及有關功能的影響。
　　方法:針對MexB基因設計并合成2條小分子干擾RNA( small interfering RNA, siRNA)序列,將帶有siRNA質粒電轉入PAO1。應用E-test方法檢測PAO1抗生素MIC的變化。半定量RT-PCR和定量PCR方法檢測mexB的表達變化。
　　結果:經酶切鑒定siRNA表達載體構建成功

9、,siRNA能明顯提高PAO1對抗生素的敏感性,RT-PCR結果顯示干擾后的PAO1mexB基因表達明顯下降(p<0.05)。
　　結論: siRNA成功干擾MexAMexB-OprM外排泵MexB基因的表達,提高銅綠假單胞菌對抗生素的敏感性,本研究顯示采用RNA干擾方法為臨床上治療耐藥菌引起感染提供新的思路。
　　第二部分 siRNA干擾銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵MexB基因表達的體內研究
　　目的:探討

10、siRNA分子對銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵mexB基因表達及有關功能的體內研究。
　　方法:建立銅綠假單胞菌小鼠肺部感染的模型觀察siRNA干擾MexB基因的效應,抗菌藥物美羅培南治療感染后小鼠,腹腔注射美羅培南(Meropenem,100mg/kg,2次/d)。觀察各組小鼠肺大體和鏡下病理改變情況,細菌計數,ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-1b和IL一12表達水平,同時檢測肺組織MPO表達水平。

11、r>　　結果:siRNA干擾組小鼠,感染后3d,5d,7d的肺部細菌負荷明顯下降。相對于siRNAnon組和Scrambled siRNA組, siRNA組小鼠具有明顯減輕的病理學改變。在感染早期(3d) siRNA干擾組,中性粒細胞的募集(MPO)和炎性細胞因子(IL-1b和IL-12)升高,在感染后期(7d)表達水平下降。
　　結論:體內研究顯示,siRNA能有效減少小鼠慢性肺部感染的細菌載量,以 MexB為靶基因設計的siR

12、NA分子為治療銅綠假單胞菌慢性感染的提供新方法。本研究為慢性銅綠假單胞菌肺部感染的治療提供了新的思路。
　　第三部分 MexAB-OprM外排泵變異對小鼠銅綠假單胞菌慢性肺部感染中的影響
　　目的:觀察銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)野生株和MexAB-OprM外排泵變異菌株對小鼠致病性的差異,了解 MexAB-OprM外排泵基因組在銅綠假單胞菌感染致病過程中的作用。
　　方法:應用E

13、-test方法檢測銅綠假單胞菌 K767(wild type)野生型, nalB(MexAB-OprM efflux mutant)突變型,△mexB(knockout strain)敲除型對不同抗生素 MIC值的變化。建立野生株 K767,nalB和△mexB(1×107CFU/ml)小鼠肺部感染模型,并應用腹腔注射美羅培南(meropenem100mg/kg,2次/d)治療感染后小鼠,治療后第3d,7d,14d進行各組小鼠肺臟病理學

14、分析,細菌學,檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞因子的水平。同時檢測肺組織 MPO變化,以及血清巨噬細胞炎癥蛋白-2MIP-2的表達。
　　結果:E-test結果顯示,相比K767和nalB菌株,△mexB菌株對抗生素亞胺培南(IP)、帕尼培南(ETP)、美羅培南(MP)的敏感性增強;三者對頭孢吡肟(TM)的敏感性沒有明顯差異。△mexB組小鼠感染后3d,7d,14d的肺部細菌負荷明顯下降,同時該組小鼠具有明顯減輕的肺臟病理學

15、改變。相比于K767和nalB組,在感染早期(3d)△mexB組,中性粒細胞的募集(MPO)升高,在感染后期(14d)炎性細胞因子表達水平下降。各組△mexB組MIP-2的水平在感染期間均持續(xù)升高,與K767和nalB組相比,組間差異顯著,p<0.05。
　　結論:MexAB-OprM外排泵缺陷菌株△mexB組的肺部病變明顯輕于野生銅綠假單胞菌k767和外排泵變異nalB組,這表明MexAB-OprM外排泵系統在銅綠假單胞菌慢性肺