抗CD44粘附分子單克隆抗體對HL-60白血病細胞增殖及分化的影響及其機制探討.pdf

1、河北醫(yī)科大學博士學位論文抗CD44粘附分子單克隆抗體對HL60白血病細胞增殖及分化的影響及其機制探討姓名：郝洪嶺申請學位級別：博士專業(yè)：內科學指導教師：董作仁20040401中文摘要觀察CD44單克隆抗體A3D8對急性髓系白血病細胞增殖、分化的影響效應，探討CD44分子途徑的作用機制，希望能為白血病的誘導分化治療提供一條新思路。方法：1細胞培養(yǎng)及CD44結合反應將人AML—M2型細胞系IlL一60培養(yǎng)于含體積分數(shù)為15％的滅活胎牛血清、

2、100U／ml的青霉素和10099／ml硫酸鏈霉素的RPMll640培養(yǎng)液中，置37。C、體積分數(shù)為5％的二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，實驗用對數(shù)生長期細胞，臺盼藍染色拒染率均在95％以上。將密度為1X105／ml的HL60細胞懸液接種在96孔平底培養(yǎng)板，每孔200gl，分別加入不同濃度的抗CD44單克隆抗體(克隆號A3D8，鼠IgGl)，常規(guī)培養(yǎng)6天，于不同時間收集細胞用于實驗。所有實驗同時用相同濃度的同型對照抗體(小鼠

3、IgG，)作為對照組。2抗CD44單抗A308對HL60細胞增殖活性的影響21MTT實驗將1X103／ml細胞懸液接種在96孔平底培養(yǎng)板，每孔200ul，分別加入終濃度為03、06、12和24gg／ml的A3D8進行孵育。每個濃度接種3個復孔，培養(yǎng)1～6天。培養(yǎng)結束前6小時每孔加入20u1MTT溶液，離心棄上清，加入200“l(fā)二甲基亞砜(DMSO)充分溶解結晶物，酶標儀測490nm處吸光度A值，繪制細胞生長曲線并計算增殖抑制率。22臺盼

4、藍活細胞計數(shù)如上法將濃度為2扯∥ml的A3D8與培養(yǎng)細胞共孵育，連續(xù)6天，每天取適量細胞懸液混勻，025％臺盼藍染色，計數(shù)拒染的活細胞數(shù)并繪制生長曲線。23FCM檢測CD71表達收集A3D8(2pg／m1)孵育72小時的IlL60細胞1104個，加入lOlalFITC偶聯(lián)的CD71抗體，49C避光放置30分鐘，冷PBS沈滌后FCM檢測CD71陽性細胞百分比。3抗CD44單抗A3D8對HL60細胞髓系分化的影響31FCM檢測系別抗原表達變

5、化分別收集A3D8及對照抗體孵育的細胞并調整為5X105／ml，取細胞懸液各100“l(fā)，分別加入PE或FITC偶聯(lián)的抗CDllb、CDl4、CDl5單抗10pl，4℃避光放置30分鐘，冷PBS洗滌后FCM檢測各分化抗原表達陽性率。32光學顯微鏡細胞形態(tài)觀察于不同時間收集A3D8孵育的IlL一60細胞，離心制片后WrightGiemsa染色，光鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。33NBT還原試驗取A3D8作用的HL60細胞2105個，懸浮于700／