兔BMSCs和納米仿生支架構(gòu)建功能性管狀組織工程骨.pdf

1、運(yùn)用組織工程骨是修復(fù)因創(chuàng)傷(燒傷)、炎癥、腫瘤導(dǎo)致的各種骨缺損的主要發(fā)展方向，而其中培養(yǎng)具有正常骨的基本形態(tài)和基本功能的功能骨是研究工作的主要目標(biāo)。近年來，骨組織工程的研究在種子細(xì)胞，支架材料，培養(yǎng)手段等方面取得了很大進(jìn)展，干細(xì)胞培養(yǎng)和納米材料技術(shù)在骨組織工程中得到運(yùn)用。目前組織工程骨的構(gòu)建大多仍沿襲直接將單個種子細(xì)胞種植于支架在體內(nèi)成骨這一基本模式，將組織工程骨廣泛運(yùn)用于臨床仍需克服大量技術(shù)問題，主要包括：種子細(xì)胞的體外規(guī)模化擴(kuò)增方法

2、；支架材料的選擇；種子細(xì)胞與支架材料有效均勻的結(jié)合；大塊組織工程骨的中心供養(yǎng)；組織工程骨的體外最佳培養(yǎng)時間及方法；組織工程骨中支架材料的降解殘留問題；體內(nèi)組織工程骨的血管化；不同形態(tài)組織工程骨的構(gòu)建等。構(gòu)建具有正常骨的基本形態(tài)和基本功能的功能性組織工程骨是目前骨組織工程研究的熱點(diǎn)問題，也是組織工程骨廣泛運(yùn)用的基礎(chǔ)。 目的： 采用2周-8周兔的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow cellsBMSCs)作為種子細(xì)胞，電

3、紡納米仿生材料聚已內(nèi)酯-I型小牛膠原(polycaproactone collagen I PCL-CO)作為支架材料，運(yùn)用細(xì)胞成膜技術(shù)將兔BMSCs膜與PCL-CO在旋轉(zhuǎn)式組織反應(yīng)器中培養(yǎng)形成管狀骨后埋植于裸鼠皮下，進(jìn)而組織工程出血管化的功能骨。通過力學(xué)測試、組織切片、免疫組化及現(xiàn)代分子生物學(xué)等方法分析組織工程管狀功能骨的機(jī)械強(qiáng)度，組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞功能，此組織工程方法為進(jìn)一步在臨床上運(yùn)用組織工程骨修復(fù)骨缺損奠定實(shí)驗基礎(chǔ)。 方法：

4、 1.采用密度梯度離心及貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法分離兔的BMSCs，進(jìn)行純化擴(kuò)增，對其細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行觀察；使用傳代2-3期細(xì)胞進(jìn)行三相誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞。 2.電紡合成電紡納米纖維PCL-CO采用細(xì)胞活力檢測，電鏡檢測，激光共聚焦顯微鏡檢測電紡納米纖維PCL-CO的基本結(jié)構(gòu)，生物相容性。 3.將經(jīng)成骨誘導(dǎo)后兩周的兔BMSCs細(xì)胞膜片(cell-sheet)與電紡納米纖維PCL-CO膜復(fù)合，在旋轉(zhuǎn)

5、式組織反應(yīng)器中繼續(xù)誘導(dǎo)分化動態(tài)培養(yǎng)4周及8周后，進(jìn)行組織切片HE、茜素紅、番紅-快綠染色(safaranin-O/fast green)和免疫組化檢測I型膠原、OCN、OPN、II型膠原表達(dá)及組織生物力學(xué)測試。 4.將經(jīng)過在旋轉(zhuǎn)式組織反應(yīng)器中誘導(dǎo)分化動態(tài)培養(yǎng)8周形成的管狀功能骨植入裸鼠皮下，觀察局部組織反應(yīng)情況，分別于植入后4周、8周取出，進(jìn)行組織切片和免疫組化檢測I型膠原、OCN表達(dá)及生物力學(xué)測試。 結(jié)果： 1

6、.采用密度梯度離心及貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法可分離得到純化2周-8周兔的BMSCs細(xì)胞在合適的誘導(dǎo)條件下，體現(xiàn)出三相分化能力，在相應(yīng)的誘導(dǎo)中，細(xì)胞表現(xiàn)出特異的生理生化反應(yīng)以及特異蛋白和組織學(xué)特征。 2.電紡納米纖維PCL-CO有良好的物理特性及細(xì)胞相容性。 3.BMSCs細(xì)胞膜片與電紡納米纖維PCL-CO膜復(fù)合以后，在成骨誘導(dǎo)下及生物反應(yīng)器中，可以形成有機(jī)械強(qiáng)度的和骨特異蛋白表達(dá)的組織。 4.體外培養(yǎng)的人工組織可以在

7、體內(nèi)形成高度血管化的管狀骨，機(jī)械強(qiáng)度可超過200MPa，組織中含有軟骨及松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)，大部新生骨組織為軟骨內(nèi)成骨。 結(jié)論： 1.采用密度梯度離心及貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法分離的2周-8周齡的兔BMSCs在合適的培養(yǎng)條件下，具有細(xì)胞性狀穩(wěn)定，純化擴(kuò)增較容易，在特定的誘導(dǎo)條件下，能向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等不同細(xì)胞分化，是理想的組織工程種子細(xì)胞。 2.采用電紡技術(shù)合成的納米纖維PCL-CO對兔BMSCs細(xì)胞的增殖活性

8、無影響，對BMSCs的吸附性較好，是一種較理想的組織工程材料。 3.運(yùn)用Cell-sheet技術(shù)在生物反應(yīng)器的動態(tài)培養(yǎng)下，兔BMSCs細(xì)胞膜片結(jié)合納米可降解電紡纖維支架技術(shù)培養(yǎng)出不斷生長的組織工程骨，該方法及技術(shù)系在骨組織工程的首次嘗試。 4.兔BMSCs細(xì)胞膜片/納米PCL-CO組織工程骨埋入裸鼠皮下后能夠以軟骨成骨的方式形成高度血管化的管狀骨。 5.將兔BMSCs細(xì)胞膜片/納米PCL-CO組織工程骨埋入裸鼠皮