雙靶點survivin-siRNA、XIAP-siRNA對卵巢癌A2780-s細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、背景和目的：卵巢癌（OvarianCancer，OC）是女性生殖器官常見的腫瘤之一，雖然發(fā)病率次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第3位，但它是死亡率最高的婦科腫瘤，患病初期癥狀隱匿，造成確診時60-70％的卵巢惡性腫瘤患者已至晚期，常規(guī)的手術和內分泌及化學療法均無法扭轉這些患者的生存期，尋找新的治療卵巢癌的方法迫在眉睫。近年來，人們對腫瘤的研究逐步向分子領域蔓延，以期通過基因治療達到治愈腫瘤的目的；細胞凋亡調控的紊亂是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個重要

2、環(huán)節(jié)，其中凋亡抑制蛋白家族（Inhibitorofapoptosisproteins，IAPs）是近些年來的一個研究熱點。并且研究發(fā)現(xiàn)：與卵巢癌有關的IAPs主要XIAP、survivin和CIAP2。目前，有關siRNA沉默survivin基因和XIAP基因對卵巢癌A2780-s細胞凋亡作用的研究還未見報道。本實驗中旨在探討：（1）survivin，XIAP基因分別在A2780-s細胞中的作用（2）雙靶點surviving-siRNA

3、、XIAP-siRNA對卵巢癌A2780-s細胞凋亡的影響。（3）survivin，XIAP之間的相互作用，以期達到為卵巢癌的治療提供新靶點。
　　 方法：研究對象為人卵巢癌細胞系（A2780-s）。（1）設計并且構建針對survivin和XIAP化學合成的siRNA；用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)卵巢癌A2780-s細胞，取對數(shù)生長期的細胞分別進行以下實驗。設計空白對照組（Blank組）、雙轉染組（Survivin-siRNA與XIAP

4、-siRNA）半量混合轉染、單轉Survivin-siRNA、單轉XIAP-siRNA、脂質體轉染組（Mock）；（2）通過蛋白質印跡法（Westernblot）檢測Survivin、XIAP蛋白在轉染48h后的蛋白表達情況；（3）PI染色觀察細胞轉染48h后細胞的凋亡情況；（4）通過AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞儀分析各組細胞凋亡率；（5）MTT法檢測細胞增殖率。
　　 結果：（1）成功培養(yǎng)卵巢癌細胞株；（2）w

5、esternblot結果證實survivin和XIAP蛋白在卵巢癌細胞A2780-s中有表達，并且單、雙轉染組的蛋白表達明顯受到抑制，單轉染survivin-siRNA組、單轉染XIAP-siRNA組、雙轉染組的蛋白表達量分別是0.35、0.32、0.21（P<0.05），而空白對照組、Mock組分別是1.00、0.89（P>0.05），對照組的蛋白表達量均高于轉染組；（3）PI染色結果顯示細胞調亡形態(tài)學變化，圖示轉染組細胞明顯減少，雙

6、轉染組尤為顯著，可見細胞核固縮，碎片，體積變小及凋亡小體形成，共轉染組較其單轉組結果更為明顯，藥物組細胞也相對減少，但是相對雙轉組細胞稍多；（4）通過AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞儀測得各組細胞的凋亡率，雙轉染組、單轉Survivin-siRNA、單轉XIAP-siRNA的凋亡率分別為29.67％、18.82％、19.18％（P<0.05）；空白對照組、脂質體轉染組凋亡率分別為：1.35％，4.51％（P>0.05）無明顯

7、的差異，且轉染組均高于對照組；（5）MTT法檢測轉染和未轉染的卵巢癌細胞的增值情況。雙轉染組、單轉survivin-siRNA組、單轉XIAP-siRNA組細胞的存活率分別為49％±0.56、58％±0.46、54％±0.37，轉染組細胞的存活率均低于對照組，而雙轉染組細胞的存活率明顯低于單轉組（P<0.05）。
　　 結論：（1）Survivin、XIAP基因在卵巢癌細胞株中有表達。（2）雙靶點survivin-siRNA、X