NCAM三種亞型高表達細胞模型的建立與低劑量鉛對其表達的影響.pdf

1、神經細胞粘附分子(NCAM)作為膜表面糖蛋白的一類，屬于細胞粘附分子免疫球蛋白超家族，介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質間的粘附作用，主要表達于神經系統(tǒng)，在正常神經元軸突的生長、突觸的可塑性、神經纖維的成束及學習和記憶等過程中起重要作用，影響神經系統(tǒng)的可塑性。以往研究已經證實，NCAM參與的神經活動的多個過程與鉛神經毒性機制涉及的幾個方面有關，這提示干擾NCAM的正常表達可能是鉛的神經毒機制之一。NCAM在人腦內，主要以NCAM-180、

2、NCAM-140、NCAM-120三種亞型(其分子量分別為180、140、120KD)表達。NCAM-180、NCAM-140屬跨膜糖蛋白，兩者通過跨膜區(qū)與胞內細胞骨架連接便于信號轉導，NCAM-180的胞質區(qū)比NCAM-140的含氨基酸殘基多，NCAM-120無胞質區(qū)及跨膜區(qū)，通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)直接與膜相連，易于在膜表面運動，且只錨定于膜上的脂筏區(qū)域。NCAM三種亞型在神經生長發(fā)育中的表達、功能和胞內信號傳導的過程有所不同，

3、這可能與它們存在的結構差異有關，但其結構與功能的具體關系目前研究還不多，還有待進一步研究。本研究擬通過基因工程技術建立NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120三種亞型各自的高表達細胞模型，并初步探索低劑量鉛對三種NCAM亞型表達的影響，為進一步探索鉛的神經發(fā)育毒性機制與NCAM的神經發(fā)育調節(jié)機制的關系打下基礎。
　　 研究目的：
　　 1.建立NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120三種亞型各自的

4、高表達細胞模型。
　　 2初步探索低劑量鉛作用對NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120表達的影響。
　　 研究內容與方法：
　　 1.建立NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120高表達細胞模型轉染方法的探索：對lipofactaneTM2000、磷酸鈣和FuGENE(R)HD Transfaction Reagen三種試劑的轉染效果進行比較，并優(yōu)化有關轉染條件。分別用此三種方法對HEK-

5、293細胞轉染綠色熒光蛋白表達質粒(PMIG-GFP)，其中l(wèi)ipofactaneTM2000設DNA(μg)：lipofactaneTM2000(μl)為1∶1.25、1∶2.5、1∶3.75三種比例，F(xiàn)uGENE(R)HD TransfactionReagen設質DNA(μg)：FuGENE(R) HD Transfaction Reagen(μl)為2∶3、2∶4、2∶5、2∶6、2∶7、2∶8六種比例進行轉染，顯微鏡下觀察轉染后

6、48小時細胞熒光蛋白的表達情況以比較此三種方法的轉染效果。
　　 2.NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120高表達細胞模型的建立：擬建立SH-SY5Y細胞和HEK-293細胞的NCAM亞型高表達模型，對SH-SY5Y細胞和HEK-293細胞分別轉染T4-NCAM180、T4-NCAM140、T4-NCAM120質粒，并使用免疫熒光和Western blot方法檢測轉染后蛋白表達的情況，以判斷高表達細胞模型的建立的結

7、果。
　　 3.低劑量鉛作用對NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120表達的影響：以低濃度PbCl2對成功建立的高表達細胞模型進行染毒，用Western blot方法檢測NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120蛋白表達情況。
　　 研究結果：
　　 1.建立NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120高表達細胞模型轉染方法的探索
　　 1.1在FuGENE(R) HD Tr

8、ansfaction Reagen轉染中，當DNA(μg)：FuGENE(R) HDTransfaction Reagen(μl)為2∶6和2∶7時的轉染率較高，均可達80％以上。
　　 1.2在lipofactaneTM2000轉染中，DNA(μg)：lipofactaneTM2000(μl)為1∶2.5和1∶3.75時的轉染率較高，均可達50％～60％，比例為1∶3.75時轉染試劑對細胞的毒作用較大，轉染過程中產生的死細胞較

9、多。
　　 1.3三種試劑對HEK-293細胞進行PMIG-GFP質粒的轉染中以FuGENE(R)HDTransfaction Reagen2∶6和2∶7的比例時的轉染效率較高，且細胞毒性較少，在轉染過程中罕見細胞死亡，細胞形態(tài)、生長狀態(tài)均保持良好。
　　 2.NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120高表達細胞模型的建立
　　 2.1以lipofactaneTM2000和FuGENE(R) HD Tr

10、ansfaction Reagen對SH-SY5Y細胞轉染T4-NCAM180、T4-NCAM140、T4-NCAM120重組質粒，檢測轉染48h后蛋白表達情況，經免疫熒光與Western blot法檢測，結果顯示無NCAM亞型蛋白高表達。
　　 2.2以FuGENE(R) HD Transfaction Reagen對HEK-293細胞轉染T4-NCAM180、T4-NCAM140、T4-NCAM120重組質粒，檢測轉染48h

11、后蛋白表達情況，Western blot檢測結果顯示HEK-293細胞經轉染后可高表達NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120蛋白。
　　 3.低劑量鉛作用對NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120表達的影響
　　 3.1本研究選取1μM和10μM PbCl2作用于NCAM-180高表達HEK-293細胞，結果顯示染毒12h后兩個劑量組的蛋白表達均比對照組降低，而染毒24h后蛋白表達降低得更為明顯

12、；且無論是染毒12h還是24h，10μM Pb2+比1μM Pb2+蛋白表達降低得更為明顯。
　　 3.2在對NCAM-140高表達HEK-293細胞的作用中，12h作用后1μM與10μM組均較對照組NCAM-140表達要減少，而1μM與10μM組間表達相差不大，經24小時作用后1μM與10μM組NCAM-140表達較對照組更明顯降低，且10μM組比1μM組的降幅明顯要更大。
　　 3.3在對NCAM-120的影響實驗中

13、，12h作用后鉛1μM與10μM組的表達量較對照組略有降低，而此降幅不如對NCAM-180和NCAM-14012h作用時明顯。經24h作用后兩染毒組NCAM-120表達量較對照組明顯下降，降幅較12h作用時大，且10μM組的蛋白表達降低得更為明顯。
　　 結論：
　　 1.從轉染后蛋白表達情況看，本實驗建立的HEK293細胞轉染模型能夠高表達NCAM-180、NCAM-140、NCAM-120。
　　 2.實驗結