膽道閉鎖致病基因的檢測及功能研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、膽道閉鎖(biliary atresia,BA)是兒童最常見的嚴重肝臟疾病,病因至今未明,既往的研究多局限于某些炎癥細胞或因子在發(fā)病中的作用,但是不同的細胞與細胞間,分子與分子間存在復雜的網(wǎng)絡聯(lián)系,這些細胞和因子哪些處于始動環(huán)節(jié),哪些處于核心通路或是相應的下游環(huán)節(jié),始終未能闡明。為進一步闡明該病的發(fā)病機制,本研究借助基因芯片及生物信息學技術在全基因組水平對基因表達譜及基因間的相互關系進行研究。對于所得到的關鍵基因對其在膽道閉鎖肝臟中的表

2、達及突變情況進行了驗證。同時在體外細胞培養(yǎng)中對可能存在的關鍵調控基因的功能進行深入研究。
  第一部分膽道閉鎖基因表達譜特點及生物信息學分析
  目的:利用基因芯片技術及生物信息學方法對膽道閉鎖的基因表達譜進行研究,以進一步闡明該病的發(fā)病機制。
  方法Trizol一步法提取膽道閉鎖組及膽總管囊腫組肝臟組織的總RNA,利用人全基因組基因表達芯片研究膽道閉鎖及膽總管囊腫肝臟組織基因表達譜間的差異,并對所得差異基因進行表達

3、趨勢顯著性及功能分析、信號傳導通路顯著性分析,并構建基因間相互作用網(wǎng)絡,尋找在膽道閉鎖發(fā)病過程中的顯著性的基因表達趨勢、信號通路及關鍵調控基因。
  結果:膽道閉鎖與膽總管囊腫相比存在1000余條差異基因;通過對表達譜芯片所得差異基因的分析,得到:
  (1)趨勢21及23兩個最具顯著性的表達趨勢。趨勢21的基因功能主要涉及組織相容性抗原復合物Ⅱ介導的外源性抗原呈遞作用以及由此導致的免疫反應。趨勢23的基因功能主要涉及器官組

4、織發(fā)育、細胞外基質形成,陰離子轉運與磷酸基團轉運。
  (2)趨勢21涉及的顯著性通路主要為細胞凋亡調控(與炎癥及組織重構有關),細胞基質代謝以及細胞粘附、花生四烯酸類物質的合成(與炎癥反應相關);趨勢23主要涉及細胞基質代謝(參與組織重構)、炎癥反應、花生四烯酸類物質的合成、增殖與遷移能力。
  (3)其中趨勢21的關鍵基因包括ITGAM、ITGB2、TNFSFR21、RGS19,趨勢23的關鍵基因包括LAMC1、LAMA

5、5、MMP7、TIMP2、MMP11。
  (4)通過基因調控網(wǎng)絡構建發(fā)現(xiàn)LDOC1基因可能在膽道閉鎖發(fā)病中起關鍵調控作用。
  結論:
  (1)膽道閉鎖的發(fā)病與MHCⅡ類分子介導免疫炎癥及組織重構密切相關。
  (2)其中ITGAM、ITGB2、TNFSFR21、RGS19和IAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11分別在趨勢21和趨勢23中具有重要作用。
  (3)LDOC1基因可能在膽

6、道閉鎖發(fā)病過程中起著核心調控作用。
  第二部分膽道閉鎖關鍵致病基因的表達及突變研究
  目的:研究第一部分實驗中發(fā)現(xiàn)的膽道閉鎖中關鍵基因的表達及突變情況,以驗證基因芯片結果并進一步揭示該病的發(fā)病機制。
  材料與方法:
  (1)22例膽道閉鎖患兒和14例膽總管囊腫患兒手術活檢肝臟標本,利用RT-PCR方法對趨勢21和趨勢23所發(fā)現(xiàn)的關鍵基因ITGAM、ITGB2、TNFRSF21、RSGl9和LAMC1、LA

7、MA5、MMP7、TIMP2、MMP11進行了半定量檢測。同時以Real-time PCR的方法對LDOC1基因進行了定量檢測。
  (2)抽取10例膽道閉鎖患兒外周靜脈血2ML,抽提基因組DNA,對目的基因ITGB2和LDOC1基因外顯子進行擴增純化并測序,了解其突變及SNP改變情況。
  結果:
  (1)膽道閉鎖肝臟組織中ITGAM、ITGB2、TNFRSF21、RSGl9、LAMC1、LAMA5、MMP7、TI

8、MP2、MMP11及LDOC1均較膽總管囊腫明顯升高(P<0.05)。
  (2)對ITGB2基因16個外顯子進行PCR擴增、純化、測序,測序結果與NCBI參考序列進行比對,發(fā)現(xiàn):9例患兒(9/10)存在ITGB2基因單核苷酸多態(tài)性改變。這些改變包括3個突變和11個SNP改變。其中突變分別是N212Y(2/10),Y544H(1/10),P752S(4/10);SNP改變包括:-156T/C(5/10),117G/A(1/10),

9、919G/A(5/10),1101C/A(4/10),1533C/T(1/10),3’-UTR+123C/T(4/10),3’-UTR+140G/A(4/10)。3’-UTR+148C/A(6/10),3’-UTR+170C/T(8/10),3’-UTR+219T/C(1/10),3’-UTR+286C/T(3/10)。LDOC1基因僅有1個外顯子,與參考序列相比,在3例患兒(3/10)存在單核苷酸多態(tài)性改變。共有1處SNP改變,為3’

10、-UTR+822C/T。
  結論
  (1)膽道閉鎖中,ITGAM、ITGB2、TNFRSF21、RGS19、LAMC1、LAMA5、MMP7、TIMP2、MMP11、LDOC1等關鍵基因表達升高,這些基因的功能主要涉及免疫炎癥及細胞外基質重建,說明它們可能參與膽道閉鎖炎癥及纖維化的進程。
  (2)膽道閉鎖中ITGB2基因外顯子區(qū)存在多處突變及單核苷酸改變。LDOC1基因外顯子區(qū)存在1處SNP改變。這些突變可能導致

11、相關蛋白結構及功能改變,從而參與膽道閉鎖的發(fā)病。而SNP改變的存在,可能與膽道閉鎖的疾病易感性相關。
  第三部分關鍵致病基因LDOC1對T淋巴細胞炎癥反應的影響
  目的:體外研究LDOC1基因高表達對T淋巴細胞Th1類炎癥因子表達的影響。
  方法:體外構建plRES2-EGFP-LDOC1質粒,將pIRES2-EGFP-LDOC1和空白質粒pIRES2-EGFP重組并包裝腺病毒,感染Jurkat細胞,利用west

12、ernblot的方法研究LDOC1蛋白的表達,利用Elisa的方法研究無轉染組、pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組和Pad-IRES2-EGFP組細胞在靜息狀態(tài)和PMA激活狀態(tài)下Th1類炎癥因子TNF-α、IL-2、IFN-γ的表達情況。
  結果:成功構建pIRES2-EGFP-LDOC1質粒,并利用腺病毒包裝后轉染Jurkat細胞。轉染LDOC1組(pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組)較陰性轉染組(Pad-IR

13、ES2-EGFP組),LDOC1蛋白表達明顯升高。轉染LDOC1組(pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組)較陰性轉染組(Pad-IRES2-EGFP組),在靜息狀態(tài)下在炎癥因子產(chǎn)生上并無明顯差異,但在經(jīng)PMA刺激后,LDOC1組(pAD-LDOC1-IRES2-EGFP組)較陰性轉染組(Pad-IRES2-EGFP組)TNF-α、IL-2、IFN-γ的表達均明顯升高,經(jīng)統(tǒng)計學檢驗具有顯著性差異(p值分別為0.0099、0.0043

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