DENND2D抑制非小細胞肺癌增殖能力和致瘤性的研究.pdf

1、背景:本實驗室曾利用抑制性消減雜交技術(suppression subtractive hybridization，SSH)對比了肺癌與癌旁組織差異表達基因，發(fā)現DENND2D基因在肺癌中低表達。但迄今為止尚未發(fā)現有關于DENND2D的功能報道。
　　 目的:本課題旨在發(fā)現DENND2D在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的表達規(guī)律以及在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的功能。
　　 方法:利用半定量PCR方法比較了15例原代培養(yǎng)的支氣管上皮

2、細胞株(primarycultured bronchial epithelial cell strains， PBEs)、永生化支氣管上皮(immortalizedhuman bronchial epithelial， IHBE)細胞以及27對肺癌/癌旁組織的DENND2DmRNA表達水平。檢測了9株非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)細胞系DENND2D基因DNA拷貝數、mRNA表達水平以及

3、蛋白表達水平。利用免疫組織化學(immunohistochemistry， IHC)的方法檢測了97例肺癌病人肺癌組織/癌旁組織的DENND2D蛋白表達水平，并利用Fisher精確檢驗對比了兩者之間的表達差別。利用細胞增值實驗、集落形成實驗以及軟瓊脂凝膠集落形成實驗檢測了DENND2D對肺癌細胞增殖的影響。利用裸鼠成瘤實驗檢測了DENND2D對肺癌細胞成瘤性的影響。接著我們利用Western blot技術以及流式細胞儀技術(fluore

4、scence-activated cell sorting，FACS)檢測了過表達DENND2D肺癌細胞系凋亡的變化情況。最后我們利用CCK-8檢測了外源過表達DENND2D的H1299細胞系經過化療藥物順鉑處理后細胞存活的IC50值的變化，并利用Western blot技術檢測了外源過表達DENND2D的H1299細胞順鉑敏感基因PARP1以及PARP1的DNA修復功能標志物蛋白PAR的表達量。
　　 結果:DENND2D m

5、RNA在PBEs中高表達(15/15)，但在IHBE(3/3)和NSCLC細胞系(8/9)中均為低表達。在NSCLC細胞系中，DNA拷貝數也出現降低(6/9)。與癌旁組織相比，肺癌組織中的DENND2D mRNA表達水平(13/27)與蛋白表達水平(23.6％ vs81.5％，p＜0.001)均顯著下調。IHC數據顯示DENND2D在腫瘤組織(IRS=0.90)以及癌前病變組織(IRS=1.38)的蛋白表達水平顯著低于癌旁組織(IRS=

6、1.97)。功能上講，過表達DENND2D的NSCLC細胞系其細胞增殖能力、集落形成能力以及錨定非依賴生長能力均受到抑制。體內實驗數據也表明DENND2D可以抑制肺癌細胞腫瘤形成能力。接下來我們檢測了凋亡標志物cleaved PARP，其表達量在外源過表達的細胞中表達上調。FACS的數據也顯示外源過表達的細胞凋亡率顯著上升，并與DENND2D表達水平呈正相關。CCK-8檢測順鉑處理的DENND2D過表達H1299細胞存活數據顯示，相對于

7、對照組，其IC50(50％ inhibiting concentration)值顯著降低。同時外源過表達DENND2D的H1299細胞PARP1和PAR的表達顯著降低。
　　 結論:DENND2D的低表達調控機制非常復雜，同時其低表達在肺癌腫瘤形成過程中是一個早期事件。在NSCLC細胞增殖和致瘤性兩方面DENND2D均扮演著重要角色。其在NSCLC細胞中的功能主要表現為誘導凋亡和增強非小細胞肺癌細胞順鉑細胞毒性敏感性。
　

8、　 實驗背景:本實驗室前期研究發(fā)現Brk1基因在參與Rac-Arp2/3的信號傳導中具有較為重要的生物學地位，其異常表達可能是腫瘤細胞獲得轉移潛能的重要因素之一。目前有關HSPC300起始密碼子上游的基因結構，順式調控元件，以及相應的反式作用因子等均不清楚。
　　 實驗目的:在轉錄水平了解引發(fā)HSPC300基因高表達的調控機理，為腫瘤細胞如何獲得轉移潛能提供更深層次的分子機理，為尋找控制細胞遷移運動的靶通路提供線索。
　

9、　 實驗方法:利用轉錄因子預測軟件對Brk1基因5'側翼區(qū)7KB范圍進行預測，找到轉錄因子相對集中的區(qū)域，利用正常人類基因組DNA為模板進行擴增并測序。利用此為模板，對其分段擴增，并將上述片段克隆到熒光素酶報告基因質粒中成為重組質粒，并利用熒光素酶雙報告基因平臺檢測其轉錄活性。利用截短法逐步截短活性強的片段，利用片段熒光素酶活性的改變找到Brk1基因核心啟動子區(qū)所處位置。利用表達譜芯片數據篩選出非小細胞肺癌中與轉移相關并與Brk1基因

10、表達呈正相關的轉錄因子，與候選Brk1基因核心啟動子區(qū)片段熒光素酶報告基因重組質粒共轉染，檢測熒光素酶活性是否增高。同時利用轉錄因子預測軟件對候選Brk1基因核心啟動子區(qū)進行分析，找到轉移相關候選轉錄因子結合位點，將其突變，并檢測其熒光素酶活性是否降低。
　　 實驗結果:我們利用轉錄因子預測軟件TFsearch和MATCHTM對Brk1基因5'側翼區(qū)7KB范圍進行預測，找到了轉錄因子相對集中的上游4.5KB區(qū)域并進行了擴增，測序

11、結果顯示與GenBank序列完全比對。分段擴增得到片段F1、F3、F5和F8，經過測序也與GenBank完全比對。雙熒光素酶雙報告基因檢測結果顯示片段F3和F8以及全長熒光素酶活性均顯著增強，其中片段F3弱于片段F8。利用熒光素酶雙報告基因檢測片段F3和F8的截短體，發(fā)現了位于-3661-3212區(qū)段的候選弱啟動子，位于-1314-934區(qū)段的候選增強子，位于-94-1（片段S831）區(qū)段的候選核心啟動子區(qū)。通過對mRNA表達譜芯片數據

12、的分析，我們找到了8個與非小細胞肺癌轉移相關，并與Brk1基因表達呈正相關的候選轉錄因子。與片段S831共轉染，發(fā)現在A549和H1299細胞中Jun能顯著增強S831的轉錄活性，增強倍數分別為3.90倍和3.56倍。候選轉錄因子結合位點突變實驗結果顯示Sp1結合位點(-78-74)突變后S831片段的轉錄活性大大降低，在三株細胞中均降低90％以上。
　　 結論:起始密碼子上游-78-74區(qū)段是Brk1基因核心啟動子區(qū)，Sp1蛋