肥大細胞在糖尿病腎病腎間質纖維化中的作用及機制研究.pdf

1、糖尿病腎臟疾病(Diabetic kidney disease，DKD)已成為終末期腎功能衰竭的最重要原因之一。DKD早期可出現(xiàn)腎小管間質纖維化，且不依賴腎小球病變直接加速腎功能的惡化，但其機制復雜。研究腎間質纖維化的發(fā)病機理、靶向阻斷參與纖維化的細胞及信號通路，延緩DKD腎小管間質纖維化、阻止腎功能的進展已成為當前的研究熱點。
　　 以往認為DKD是一種非炎癥性疾病，近年來關于炎癥細胞及炎癥因子在DKD腎間質纖維化中的作用越來

2、越受到重視，而肥大細胞作為一種重要的炎癥細胞也逐漸被關注。肥大細胞起源于骨髓CD34+多能祖細胞，肥大細胞胞漿顆粒中富含炎癥介質，大量研究發(fā)現(xiàn)肥大細胞參與了許多慢性腎臟病的腎間質纖維化。有研究報道DKD患者腎活檢組織中腎間質肥大細胞表達明顯增加，并與腎間質纖維化的程度及腎功能的進展密切相關。但肥大細胞參與DKD腎間質纖維化的具體作用機制及信號通路尚不完全清楚。
　　 SCF/c-Kit是促進肥大細胞的募集及活化的信號通路，SCF

3、、c-Kit可在腎間質細胞及腎小管上皮細胞中表達，而且SCF可促進膠原的合成及細胞外基質的聚集，其在DKD腎間質纖維化中的作用有待進一步研究。
　　 目的：
　　 本課題擬通過檢測DKD患者腎組織，同時建立DKD動物模型，從三個方面進行研究:1、檢測肥大細胞在DKD患者腎間質的浸潤情況及與腎間質纖維化的關系;2.通過肥大細胞膜穩(wěn)定劑——曲尼斯特干預，觀察肥大細胞對DKD大鼠腎間質纖維化的作用;3.通過曲尼斯特干預，探討肥

4、大細胞介導DKD腎間質纖維化的機制是否與阻斷SCF/c-kit有關。研究肥大細胞在DKD腎間質纖維化中的作用及機制，為開發(fā)研究延緩腎功能進展的有效藥物提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.收集2010～2011年來我院腎內科就診，并于我院腎臟病研究所行腎活檢，結合臨床及病理診斷為DKD患者共14例。同時選取7例診斷為微小病變的病例作為對照組，所選取的對照組腎組織病變輕微，未見明顯炎癥細胞浸潤及間質纖維化。應用甲苯胺藍染

5、色檢測肥大細胞浸潤，免疫組化檢測DKD腎組織及微小病變腎組織肥大細胞特異性標志——C3aR的分布情況
　　 2.建立DKD大鼠模型:SD大鼠隨機分為正常對照組(n=6)、DKD模型組和曲尼斯特低劑量和高劑量治療組(n=24)。采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合低劑量STZ注射誘發(fā)SD大鼠DKD模型(STZ溶于0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，pH值4.5)，對照組只注射相同體積的枸櫞酸鹽緩沖液，72h后測定血糖和尿糖，血糖值＞16.7m

6、mol/L，尿糖值+++～++++者確定為糖尿病模型。成模后，曲尼斯特治療組予曲尼斯特(200mg/kg/d和400mg/kg/d)分2次灌胃。于第8周末處死大鼠，收集大鼠24小時尿液測24小時尿白蛋白排泄量，收集血測腎功能及血白蛋白，取部分腎組織置于4％中性甲醛溶液中固定，觀察各組之間腎臟病理學變化。采用免疫組化方法檢測腎組織C3aR、FN、 ColⅠ、SCF和c-kit表達以及分布情況，用Western blot及PCR方法檢測腎組

7、織FN、ColⅠ、SCF和c-kit蛋白及mRNA的表達情況。
　　 結果：
　　 1.DKD患者腎間質肥大細胞的浸潤較微小病變患者明顯增加，并與腎間質纖維化損傷及腎功能進展密切相關。
　　 2.成功構建DKD模型:72h測定血糖和尿糖，血糖值≥16.7mmol/L，尿糖值+++～++++，確定為糖尿病模型。8周末時，糖尿病大鼠的血糖顯著高于正常對照組，且出現(xiàn)了明顯的“三多一少”癥狀，檢測尿白蛋白明顯增高，Mas

8、son染色腎小管間質出現(xiàn)明顯的膠原沉積，說明DKD大鼠模型建立是成功的。正常腎組織腎小管間質區(qū)域及髓質部分偶可見肥大細胞，8周末糖尿病腎組織肥大細胞浸潤明顯增加。
　　 3.與正常對照組比較，DKD模型組肥大細胞浸潤明顯增加，腎小管間質膠原相對面積增加(P＜0.05)，腎小管間質區(qū)域ColⅠ、FN的表達增加。肥大細胞阻斷劑-曲尼斯特能明顯抑制ColⅠ、FN的表達，肥大細胞浸潤和ColⅠ、FN的表達呈正相關(P＜0.05)。

9、>　　 4.正常大鼠腎小管及腎間質可見少量SCF蛋白表達，未見明顯的c-Kit蛋白表達，DKD大鼠腎組織SCF、c-Kit蛋白及mRNA表達增加，曲尼斯特能抑制SCF、c-Kit mRNA及蛋白的表達(P＜0.05)。腎組織SCF、c-kit蛋白的表達與腎組織肥大細胞浸潤程度及腎小管間質FN、col-Ⅰ蛋白的表達呈顯著正相關。
　　 結論：
　　 (1)肥大細胞可能在DKD患者腎間質纖維化過程中起作用。