RNAi沉默整合素鏈接激酶基因?qū)σ认侔㏄ANC-1細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人申明所呈交的學(xué)位論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果也不包含為獲得我?；蚱渌逃龣C(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料’與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名：壹【皇日期：do／o多，譬中國醫(yī)

2、科大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解中國醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定即：研究生在攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬中國醫(yī)科大尊本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位為中國醫(yī)科大學(xué)，且導(dǎo)師為通訊作者，通訊作者單位亦署名為中國醫(yī)科大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤允許論文被查閱和借閱。學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容(保密內(nèi)容除外)，以采用影印、縮印或其他手段保存論文。中文論著

3、摘要RNAi沉默整合素鏈接激酶基因?qū)σ认侔㏄ANC1細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制的研究目的構(gòu)建整合素鏈接激酶(ILK)基因RNA干擾(RNAinterference，RNAi)表達(dá)載體，研究其對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞ILK基因表達(dá)的抑制作用及其對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。為研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制與治療提供理論依據(jù)。方法設(shè)計(jì)三對(duì)針對(duì)ILK基因的小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)序列，并根據(jù)該序列合成兩條小發(fā)央RNA(

4、smallhairpinRNA，shRNA)的DNA模板單鏈，同時(shí)模板鏈兩端分別設(shè)計(jì)不同的兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。退火形成siRNA載體插入片斷。用限制性內(nèi)切酶將siRNA空載體線性化，T4連接酶將插入片斷插入siRNA空質(zhì)粒中。經(jīng)PCR和測序的方法鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。通過陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000將重組質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc1細(xì)胞中，G418篩選4周后以綠色熒光蛋白(GFP)基因?yàn)閳?bào)告基因，

5、用熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒表達(dá)效率。挑選陽性單克隆繼續(xù)在G418壓力下擴(kuò)大培養(yǎng)4周后，再以GFP基因?yàn)閳?bào)告基因，用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒表達(dá)效率。應(yīng)用半定量RTPCR方法，檢測胰腺癌PANC1細(xì)胞中ILKmRNA表達(dá)水平，應(yīng)用WesternBlot方法，檢測胰腺癌PANC1細(xì)胞中ILK基因蛋白表達(dá)水平。篩選出干擾效率最高的重組質(zhì)粒。M玎筅黔：每組約2000細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，在37℃、5％C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別與Oh、24