從食管癌細胞系SHEEC中克隆調(diào)控NGAL基因的NF-κB因子的初步研究.pdf

1、近年來,有研究發(fā)現(xiàn)NGAL(neutrophil gelatinase—associated lipocalin)可能是人類的一新的癌基因,在食管上皮細胞癌變等過程中顯著過表達,但表達調(diào)控機制不清。序列分析發(fā)現(xiàn),在NGAL基因5'側翼轉錄調(diào)控區(qū)有典型的轉錄激活因子NF-kB(nuclear factor kappa B)的結合元件(GGGAATGTCC,-180~-171bp),提示NF-kB因子可能參與食管上皮細胞癌變等過程中NGAL

2、基因表達的調(diào)控。
　　NF-kB是一類普遍存在的轉錄因子家族,目前已從中鑒定出了十幾個成員,分別在不同的組織或階段,依時空特異性參與著150余種基因的轉錄調(diào)控,主要涉及免疫炎癥反應、細胞凋亡以及腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉移和耐藥等。那么在食管上皮細胞癌變等過程中,究竟有哪些NF-kB因子參與作用,其中是否有一些尚未被鑒定的新NF-kB因子存在?為此,本研究通過酵母單雜交等技術手段在食管癌細胞cDNA酵母雜交文庫中對NF-kB因子進行了初

3、步的篩選與鑒定,以期為闡明NGAL基因在食管上皮細胞癌變等過程中顯著過表達提供理論依據(jù)。
　　主要研究內(nèi)容與方法:
　　一、設計并合成誘餌片段,定向插入DNA-BD載體,通過限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序的方法鑒定正確重組子。
　　二、將攜帶正確誘餌片段的重組子轉入酵母細胞株YM4271中,通過嚴格的3-AT抑制試驗獲得酵母單雜交宿主細胞,為篩庫做準備。
　　三、篩選食管癌細胞系SHEEC的cDNA酵母雜交文庫,通

4、過反復營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)和3-AT加壓的方法收獲啟動報告基因表達的陽性候選克隆。
　　四、抽提酵母陽性候選克隆的質(zhì)粒,轉化大腸桿菌后獲得單一文庫質(zhì)粒;將純化的單一文庫質(zhì)粒再次轉入酵母單雜交宿主細胞,在酵母體內(nèi)一對一驗證激活報告基因的作用。
　　五、對酵母體內(nèi)一對一驗證的陽性克隆進行DNA測序。
　　六、對DNA測序結果進行鑒定和初步的生物信息學分析。
　　研究結果:
　　一、合成了三重NF-kB位點寡核苷酸串正反

5、鏈,退火后,定向插入DNA-BD載體,篩選鑒定,獲得了攜帶誘餌片段的重組子。
　　二、將攜帶正確誘餌片段的重組子轉入酵母細胞株YM4271中,在嚴格的3-AT壓力下獲得了基因組上整合有誘餌片段的酵母單雜交宿主細胞。
　　三、在SHEEC人食管癌細胞系cDNA酵母雜交文庫中進行篩查,獲得了陽性候選克隆351個。
　　四、對上述陽性候選酵母細胞克隆進行了質(zhì)粒的提取與酶切鑒定,獲得真正插入外源片段的陽性克隆37個。
　

6、　五、對上述37個陽性克隆在酵母細胞體內(nèi)進行一對一驗證,其中31個被證實有激活報告基因的作用。
　　六、對上述31個陽性克隆進行了DNA測序,并給予鑒定分類;在此基礎上,對部分結果進行了初步的生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)與以往NF-kB因子的p65結構不同。
　　結論:
　　一、成功建立了酵母單雜交實驗技術平臺。
　　二、從設計合成誘餌片段開始,經(jīng)過誘餌載體構建、與宿主酵母菌細胞染色體整合、篩庫、質(zhì)粒提取與酶切鑒定、酵母

7、細胞體內(nèi)一對一驗證以及DNA測序鑒定分類和初步的生物信息學分析等,結果提示,在食管癌細胞中可能存在著某種結構的NF-kB因子,而且可能是新結構。
　　三、有關NF-kB因子家族在相關基因表達調(diào)控中發(fā)揮作用是一個復雜的問題。通過本研究,在食管癌細胞中針對NGAL基因表達調(diào)控這一側面獲得了一些初步結果。今后擬采取諸如凝膠阻滯等多種實驗手段,圍繞進一步驗證結果、排除假象開展研究。
　　然而,無論如何,上述結果所展示出來的實驗事實都