線粒體DNA在α粒子致人支氣管上皮細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、目的：研究線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）在α粒子致人支氣管上皮細(xì)胞（human bronchial epithelial cells，HBE）體外惡性轉(zhuǎn)化中的作用，并探討mtDNA參與α粒子致HBE凋亡抵抗的機(jī)制。
　　方法：（1）采用溴化乙錠（ethidium bromide，EtBr）誘導(dǎo)法構(gòu)建mtDNA拷貝數(shù)降低的HBE細(xì)胞株（HBEρ-）。通過營養(yǎng)缺陷、real-time PCR、mtDNA

2、染色鑒定mtDNA的缺失情況來驗證HBEρ-。繪制細(xì)胞生長曲線以分析細(xì)胞生長速率。采用生化試劑盒檢測細(xì)胞色素C氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）的活性。利用JC-1熒光探針染色，檢測分析細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，?Ψm）。H2DCFDA染色法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species， ROS）的水平。（2）不同劑量（0、0.3、0

3、.6 Gy）的α粒子照射HBEρ+與ρ-，傳代培養(yǎng)至20代（Passage20，P20）、40代（Passage40，P40）。檢測照射后的細(xì)胞在軟瓊脂中的獨立錨著性生長能力，細(xì)胞劃痕實驗觀察細(xì)胞的遷移/侵襲特性。平板克隆形成實驗分析細(xì)胞群體依賴性和增殖能力。運用流式細(xì)胞術(shù)，采用三種不同的方法分析細(xì)胞的凋亡率：JC-1熒光染色法，測定 JC-1單聚體的比例；Annexin V-FITC/PI雙染色法，分析Annexin+/PI-比例(早

4、期凋亡率)、Annexin+/PI+比例(晚期凋亡/壞死率)；PI單染法，分析%subG1。通過繪制生長曲線，比較細(xì)胞增殖速率。以PI染色分析細(xì)胞周期分布。（3）α粒子照射后的HBEρ+與ρ-傳代培養(yǎng)至P20、P40，Western blotting分析蛋白Bax、Bcl-2、cyt-c、caspase-9、caspase-3、caspase-8的表達(dá)水平。Real-time RCR分析mtDNA拷貝數(shù)的差異。H2DCFDA熒光探針檢測

5、細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。
　　結(jié)果：（1）50 ng/ml EtBr誘導(dǎo)9 d及12.5 ng/ml EtBr誘導(dǎo)30 d后的HBE在ρ0篩選培養(yǎng)基中，漂浮死亡；Real-time PCR結(jié)果顯示，其 mtDNA拷貝數(shù)降低了76.01%；mtDNA染色法，觀察到誘導(dǎo)后的細(xì)胞的mtDNA染色微弱、數(shù)量減少。以上三點表明，EtBr誘導(dǎo)法已構(gòu)建了mtDNA拷貝數(shù)降低的 HBE細(xì)胞株（HBEρ-）。與母本HBEρ+相比，HBEρ-的生物學(xué)性狀

6、發(fā)生了改變：COX活性降低，氧化呼吸鏈損傷，生長速率減慢，?Ψm與ROS水平降低。（2）在α粒子照射后的P40， HBEρ-組的軟瓊脂克隆形成率、細(xì)胞遷移指數(shù)、平板克隆形成率比照射后的線粒體對照組HBEρ+高，惡性特征更明顯。與假照射對照組相比，α粒子照射后的P40， HBEρ+和HBEρ-細(xì)胞凋亡率均明顯降低；而且，照射后的HBEρ-的凋亡率（JC-1單聚體的比例、Annexin+/PI-比例、Annexin+/PI+比例、%subG

7、1）均顯著低于照射后的HBEρ+；且HBEρ-比ρ+凋亡抵抗能力進(jìn)展的更快。細(xì)胞生長速率分析顯示，在P40，α粒子照射后的HBEρ-比對照HBEρ+飽和密度更高，倍增時間更短。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與線粒體對照組HBEρ+相比，照射后的HBEρ-的%G1和%G2/M相對更低，而%S則顯著高于前者。（3）α粒子照射后的P20，HBEρ-中Bax的表達(dá)高于線粒體對照組HBEρ+，而在P40，兩者間沒有差異；在照射后的P20，HBEρ-中Bcl-

8、2的表達(dá)低于線粒體對照組HBEρ+，卻在P40時高于后者；在照射后的P40，cyt-c在HBEρ-中的表達(dá)高于線粒體對照組HBEρ+；在照射后的P40，HBEρ-的caspase-9的表達(dá)水平低于HBEρ+；在照射后的P20與P40，HBEρ-的caspase-3、caspase-8的蛋白表達(dá)均低于HBEρ+。α粒子照射使得HBEρ+與HBEρ-的mtDNA拷貝數(shù)均進(jìn)行性地降低。同時，α粒子使得HBEρ+與ρ-細(xì)胞內(nèi)活性氧持續(xù)處于高水平