電刺激促進大鼠視網(wǎng)膜前體細胞增殖分化的初步實驗研究.pdf

1、青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關性黃斑變性、視網(wǎng)膜脫離等疾病可以造成視網(wǎng)膜神經(jīng)元不同程度的凋亡，最終導致不可逆性視力損害。目前臨床上尚無根治這類疾病的有效方法，神經(jīng)保護藥物或神經(jīng)營養(yǎng)因子補充等方法只是著眼于保護未凋亡的神經(jīng)元，對于已經(jīng)受損的視網(wǎng)膜神經(jīng)元卻無能為力;干細胞的應用則是立足于施救已受損的神經(jīng)元，可在一定程度上逆轉(zhuǎn)疾病的進程，但干細胞移植治療仍需面臨移植細胞的免疫排斥、供體來源以及與宿主視網(wǎng)膜的有效整合等諸多問題。因此，如何原

2、位誘導自體內(nèi)源性視網(wǎng)膜前體細胞增殖、分化備受研究者的關注。目前的研究證明，睫狀體邊緣帶細胞、虹膜色素上皮細胞、Müller細胞都可能作為成年哺乳動物的視網(wǎng)膜干細胞來源，其中以睫狀體邊緣帶細胞、Müller細胞來源的視網(wǎng)膜干細胞最為重要，常常被稱為視網(wǎng)膜前體細胞。
　　電刺激(electrical stimulation，ES)在一些動物模型和臨床研究中都初步顯示了良好的促細胞增殖分化效果，且副作用小，引起了眼科學者們的關注。本研究

3、旨在探討電刺激對睫狀體邊緣帶細胞、Müller細胞來源的視網(wǎng)膜前體細胞增殖分化的影響，并對電刺激后即早基因Gadd45β在視網(wǎng)膜前體細胞增殖分化過程中的表達調(diào)控作用進行研究和探索。
　　第一部分跨角膜電刺激促進成年大鼠睫狀體邊緣帶視網(wǎng)膜前體細胞增殖分化
　　目的: 旨在探討跨角膜電刺激促進成年大鼠睫狀體邊緣帶視網(wǎng)膜前體細胞增殖分化。
　　方法: 成年雌性SD大鼠予以每日腹腔注射BrdU（100mg/kg），連續(xù)腹腔注射

4、5天用于標記增殖細胞。大鼠左眼接受電刺激（電刺激參數(shù):雙相方波電流:波寬3ms，頻率20Hz，強度300uA，刺激時間持續(xù)1h），右眼為自身對照，并設假手術組，每組每時點為4只SD大鼠。電刺激后不同時間點(1d、4d、7d、10d、14d)心臟灌注處死SD大鼠后摘除眼球制作視網(wǎng)膜冰凍切片，免疫熒光觀察睫狀體邊緣帶BrdU陽性細胞以明確增殖細胞的數(shù)量及部位并計數(shù)，免疫化學染色共聚焦顯微鏡觀察睫狀體邊緣帶BrdU陽性細胞Nestin的表達情

5、況，以明確增殖細胞是否為視網(wǎng)膜前體細胞。為了評估電刺激條件的安全性，選取電極作用部位的角膜組織，電鏡下觀察組織形態(tài)學改變。同時，在大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)檢測到即早基因Gadd45β的表達并進一步Western Blot免疫印跡法檢測電刺激后大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Gadd45β的表達水平。
　　結(jié)果: 電刺激前后大鼠角膜組織形態(tài)未發(fā)生明顯改變，提示該電刺激條件具有一定的安全性。視網(wǎng)膜冰凍切片免疫熒光觀察顯示:電刺激后第4天SD大鼠睫狀體邊緣帶細胞開始出

6、現(xiàn)BrdU陽性細胞，且電刺激后7d、10d和14d睫狀體邊緣帶BrdU陽性細胞數(shù)明顯增多，BrdU陽性細胞計數(shù)具有統(tǒng)計學意義。電刺激后第4天SD大鼠睫狀體邊緣帶BrdU細胞Nestin染色陽性，且隨時間的延長Nestin染色陽性逐漸增強，提示電刺激后大鼠睫狀體邊緣帶視網(wǎng)膜前體細胞存在增殖現(xiàn)象。電刺激后大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Gadd45β的表達一過性增加。
　　結(jié)論: 經(jīng)角膜低電流刺激后成年大鼠睫狀體邊緣帶視網(wǎng)膜前體細胞出現(xiàn)增殖現(xiàn)象，并伴有視

7、網(wǎng)膜內(nèi)即早基因Gadd45β一過性表達增加。
　　第二部分電刺激促進大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子作用的評估
　　目的: 旨在探討電刺激影響大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子。
　　方法: 選取新生2天SD大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞體外培養(yǎng)，電鏡下觀察體外培養(yǎng)的Müller細胞的形態(tài);谷氨酰胺合成酶(GS)免疫細胞化學染色鑒定體外培養(yǎng)的Müller細胞表型。參考國內(nèi)外相關文獻給予Muller細胞一定

8、模式的電刺激(電刺激參數(shù):雙相方波電流，電刺激參數(shù):波寬3ms，頻率20Hz，強度300uA，單次刺激時間1h)，電刺激后不同時間點(0h、1h、2h、3h、6h、12h)行Realtime-PCR、Western Blot檢測BDNF、bFGF神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌情況及Gadd45家族各因子的表達情況。
　　結(jié)果: 電鏡下觀察體外培養(yǎng)的SD大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞呈細長形似纖維，免疫細胞化學染色顯示Müller細胞特異性谷氨酰胺