APC基因沉默與TGF-β對人結直腸癌細胞粘附作用的相關性分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
   惡性腫瘤細胞粘附作用的減弱和缺失是腫瘤轉移的重要因素之一,而轉移是腫瘤所致死亡的主要原因之一。而E-cadherin是上皮細胞細胞間粘附作用的主要調節(jié)因子。TGF-β信號轉導通路在人類結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著廣泛的作用。了解TGF-β通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展的特定環(huán)節(jié)中的不同作用,對遺傳性結直腸癌的認識和干預提供了新的機會。WNT通路是迄今研究密度最大的通路之一,它在胚胎與腫瘤中的作用備受矚目,而其中的Wnts、APC

2、、axin和TCFs等都與腫瘤的發(fā)生關系密切。
   本研究將主要關注兩個通路在人結直腸癌細胞的粘附中的作用,并探討其可能存在的交叉調控機制。
   方法:
   APC-shRNA表達質粒的構建:使用Ambion公司的在線設計軟件,設計并合成能夠編碼針對APC基因的小發(fā)夾RNA(APC-shRNA)的寡核苷酸鏈模板,將其插入到pSliencerTM 4.1-CMV neo表達質粒載體中,形成pSliencerT

3、M 4.1-CMV-APC-shRNA重組表達質粒;應用感受態(tài)細胞E.coli DH5α擴增該重組表達質粒,利用質粒的氨芐青霉素抗藥性篩選出成功轉化的陽性克隆,并進行擴增;應用RT-PCR及基因測序方法篩選出插入APC-shRNA堿基序列無突變的重組表達質粒進行擴增純化。建立HCT-116-APC-RNAi細胞模型:應用質粒提取試劑盒提取質粒,脂質體法轉染人結直腸癌HCT-116細胞,應用RT-PCR及western blot檢測APC

4、基因mRNA和蛋白表達水平,確認APC基因沉默。分別采用RT-PCR法和western blot檢測APC基因沉默前后E-cadherin表達的變化;用Transwell法檢測APC基因沉默前后細胞侵襲水平的變化。
   結果:
   1、成功構建APC-shRNA表達質粒:含有重組質粒的陽性克隆菌液PCR擴增片段大小約為250bp,并且其基因測序結果顯示插入片段堿基排列順序正確,沒有突變,說明APC-shRNA表達質粒

5、構建成功;且EGFP證明轉染效率約為70~80%,說明質粒轉染體系有效。
   2、成功建立HCT-116-APC-RNAi細胞模型:與陰性對照組相比,轉染APC-shRNA質粒后48和72小時,APC基因mRNA表達水平均明顯減低,表達抑制率分別為63.31±6.84%、77.03±5.61%(P<0.05)。在蛋白水平,APC蛋白在轉染后的48與72小時后,抑制率為73.03±9.33%和79.51±10.13%(P<0.0

6、5)。說明APC基因沉默,HCT-116-APC-RNAi細胞模型成功建立。
   3、APC基因沉默對人結直腸癌HCT-116中TGF-β誘導E-cadherin作用的影響:與陰性對照組相比,APC基因沉默可抑制HCT-116細胞中E-cadherin的轉錄和表達,轉染后48與72小時后,mRNA與蛋白抑制率為66.35±3.65%、71.32±4.57%(P<0.05)。在蛋白水平,E-cadherin抑制率為71.10±5

7、.76%和77.54±9.16%(P<0.05)。差別具有統(tǒng)計學意義。
   4、APC基因沉默對人結直腸癌HCT-116細胞侵襲性的影響:與陰性對照組相比,APC基因沉默后,Transwell可見TGF-β對HCT-116侵襲的作用從抑制變化為促進。在對照組HCT-116細胞中,給予10ng/ml TGF-β1可以抑制約16.6%的腫瘤細胞,但是在APC沉默的HCT-116細胞中則刺激了約13.2%的腫瘤細胞侵襲。
  

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