瓦草三萜皂甙類化合物對人宮頸癌HeLa細胞的生長抑制及作用機制的研究.pdf

1、前言:
　　 目前惡性腫瘤已成為危害人類生命健康最重要的疾病之一,據(jù)世界衛(wèi)生組織報告顯示,全世界每年約1300萬癌癥新增患者,死亡約760萬,已成為威脅人類生命健康的第二大殺手,因此尋找有效的癌癥治療手段已成為必然。
　　 在惡性腫瘤的治療中,化學治療占重要地位,包括使用天然的或化學合成制劑來抑制腫瘤,而在化學合成的抗腫瘤藥物中絕大多數(shù)是以天然植物為先導化合物的藥物。因此,從天然植物成分中篩選抑制腫瘤細胞生長的藥物,已成

2、為目前尋找抗腫瘤藥物的一個理想途徑。
　　 云南民間中草藥瓦草為石竹科繩子草屬植物黏萼繩子草SileneviscidulaFranch.的干燥根,具有清熱、利濕、通淋的功效,民間主要用于治療肺熱咳嗽、濕熱淋病、風濕骨痛、頭痛、牙痛、脘腹疼痛、跌打傷痛、產(chǎn)后宮縮痛等癥,但目前尚未見瓦草的化學成分及抗腫瘤藥理作用的相關報道。
　　 本研究對沈陽藥科大學從瓦草乙醇提取物中首次分離鑒定的16個三萜皂甙類化合物和2個蛻皮甾酮類化合

3、物的抗腫瘤活性進行了初步篩查,發(fā)現(xiàn)其中3種成分具有不同程度的腫瘤細胞生長抑制作用,經(jīng)藥物結構分析證實,這三種化合物在結構上均為三萜皂甙類化合物,已有研究表明,三萜皂甙類化合物,具有化學預防、誘導腫瘤細胞分化、抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移、逆轉多藥耐藥等作用。為進一步探討瓦草三萜皂甙類化合物的抗腫瘤機制,本研究選取對8/9化合物最為敏感的HeLa細胞為研究對象,觀察其對HeLa細胞的生長抑制作用,并從抑制細胞增殖方面進一步探討瓦草三萜皂甙

4、類化合物誘導細胞周期阻滯在G1期的作用機理。
　　 方法:
　　 一、瓦草三萜皂甙類化合物對腫瘤細胞的生長抑制作用
　　 1.MTT法檢測瓦草18種提取物對人大腸癌HT-29細胞系的抗腫瘤活性
　　 2.MTT法檢測8/9化合物對不同細胞系的生長抑制作用
　　 3.CCK-8法檢測8/9、10/11、12/13三種化合物對HeLa細胞的生長抑制作用
　　 4.CCK-8法檢測8/9化合物對

5、HeLa細胞生長抑制作用的時間與劑量關系
　　 二、8/9化合物誘導HeLa細胞凋亡的作用
　　 1.8/9化合物作用HeLa細胞后的形態(tài)學觀察
　　 2.凝膠電泳檢測8/9化合物作用HeLa細胞后的DNA片段改變
　　 3.流式細胞術檢測8/9化合物作用HeLa細胞后誘導凋亡的作用
　　 三、8/9化合物誘導HeLa細胞周期阻滯作用及機制
　　 1、流式細胞術檢測8/9化合物作用HeLa

6、細胞后細胞周期阻滯作用
　　 2、WesternBlot及RT-PCR方法檢測8/9化合物對HeLa細胞G1期關鍵蛋白cyclinD1在蛋白及mRNA水平上的影響
　　 3、WesternBlot方法及免疫共沉淀方法檢測8/9化合物對HeLa細胞G1期相關蛋白水平的影響
　　 實驗結果:
　　 一、瓦草三萜皂甙類化合物對腫瘤細胞的生長抑制作用
　　 1.通過MTT法篩查瓦草18種提取物對人大腸癌H

7、T-29細胞系的抗腫瘤活性,結果顯示有多種化合物具有抗腫瘤活性,其中8/9、10/11、12/13三種化合物較其他化合物作用明顯。
　　 2.為進一步探討瓦草三萜皂甙類化合物的抗腫瘤作用,我們選取了8/9化合物進行如下實驗。通過MTT法篩查8/9化合物對不同腫瘤細胞系的生長抑制作用,結果顯示8/9化合物對多種腫瘤細胞系均有生長抑制作用,本研究選取其中對8/9化合物最為敏感的人宮頸癌HeLa細胞作為研究對象。
　　 3.通

8、過CCK-8法檢測8/9、10/11、12/13三種化合物對HeLa細胞的生長抑制作用,結果顯示8/9、10/11、12/13三種化合物對HeLa細胞均有生長抑制作用,三者活性強弱依次為8/9＞10/11＞12/13。
　　 4.CCK-8法檢測8/9化合物對Hela細胞的生長抑制作用有明顯的劑量依賴性,且在藥物作用12h即產(chǎn)生明顯的生長抑制作用。
　　 二、8/9化合物誘導HeLa細胞凋亡的作用
　　 1.不同

9、濃度8/9化合物作用HeLa細胞24h后,相差顯微鏡下對其形態(tài)學進行觀察可見:細胞變圓、體積變小、貼壁性減弱;DAPI染色后熒光顯微鏡下對其形態(tài)學進行觀察未見核固縮、核碎裂、核溶解等典型的凋亡小體形態(tài)。
　　 2.凝膠電泳檢測其DNA變化結果顯示并未出現(xiàn)凋亡特有的DNALadder條帶。
　　 3.AnnexinV-FITC/PI雙染后流式細胞術檢測結果顯示:隨著8/9化合物濃度的增加,發(fā)生早期凋亡的細胞未見增多。

10、>　　 通過以上不同實驗結果表明,8/9化合物抑制HeLa細胞增殖的作用與誘導腫瘤細胞凋亡無關。
　　 三、8/9化合物誘導HeLa細胞周期阻滯作用及機制
　　 1、PI單染后流式細胞術檢測結果顯示:隨著藥物濃度的增加,細胞阻滯在G1期。
　　 2、8/9化合物對G1期關鍵調節(jié)因子的影響:結果顯示,隨著8/9化合物作用濃度的增加,G1期關鍵調節(jié)因子cyclinD1在蛋白水平上表達下降,而在mRNA水平上未見改變

11、。
　　 3、8/9化合物能夠影響G1期相關蛋白的表達從而抑制細胞由G1期向S期轉化:免疫共沉淀方法檢測8/9化合物對HeLa細胞G1期相關因子E2F1蛋白表達量的影響。
　　 結論:
　　 1.明確瓦草中雙糖鏈三萜皂甙類化合物具有廣譜抗腫瘤活性。
　　 2.三萜皂甙類化合物可通過上調P16蛋白及下調cyclinD1蛋白表達,使Rb磷酸化水平降低,轉錄因子E2F1活性缺乏,HeLa細胞阻滯于G1期,從而抑