應(yīng)用RNAi技術(shù)研究LRP1B基因與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性.pdf

1、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1B(low density lipoprotein receptor-related protein1B，LRP1B)是低密度脂蛋白受體家族的成員。已有研究發(fā)現(xiàn)，LRP1B基因在許多人類腫瘤組織中失活，提示該基因是一個潛在的腫瘤抑制基因。進一步研究發(fā)現(xiàn)，LRP1B可調(diào)節(jié)uPA系統(tǒng)相關(guān)分子的代謝，而uPA系統(tǒng)與腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，為闡明LRP1B基因與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，本研究以HEK293細胞為材

2、料應(yīng)用RNAi技術(shù)特異地封閉LRP1B基因的表達，通過檢測HEK293細胞生物學(xué)表型的變化來評價LRP1B基因作為候選的腫瘤抑制基因與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。
　　LRP1B基因是一個轉(zhuǎn)錄本長達16.5kb的大轉(zhuǎn)錄本基因。根據(jù)高效siRNA序列特征和靶序列處的mRNA二級結(jié)構(gòu)特點，本研究對LRP1B基因多達1100個的siRNA候選靶序列進行雙重評價，最終在基因轉(zhuǎn)錄本的不同位置選取了6個siRNA靶位點。針對這些靶位點，本實驗構(gòu)建了6個

3、表達shRNA的pSilencer4.1重組體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細胞并采用半定量RT-PCR檢測各重組體的沉默效果。結(jié)果表明，本實驗所構(gòu)建的6個shRNA重組體中有5個對LRP1B基因形成了有效沉默（＞50％），并得到了多個完全封閉LRP1B基因表達的HEK293細胞單克隆。這為后續(xù)的HEK293細胞的生物表型分析提供了理想的材料。
　　本研究通過繪制細胞生長曲線和軟瓊脂集落形成實驗研究了LRP1B基因沉默后HEK293細胞生

4、長特性的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然封閉LRP1B基因的表達后HEK293細胞的生長曲線并未發(fā)生明顯變化，但在軟瓊脂中形成的集落卻有明顯變大、增多的趨勢，說明LRP1B具有抑制HEK293細胞非錨定依賴性生長的功能。本研究又通過Transwell侵襲小室實驗、細胞趨化性實驗研究了HEK293細胞侵襲和趨化性運動能力的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，封閉LRP1B基因的表達增強了HEK293細胞的侵襲和趨化性運動能力，并且增強的程度與LRP1B的基因表達封閉水平