造血干細胞向淋巴系祖細胞增殖分化過程中同源盒基因表達的研究.pdf

1、目的：本課題主要探討人類臍血造血干細胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）向淋巴系祖細胞（Colony Forming Unit-T Lymphocyte，CFU-TL）增殖分化過程中HOXC4、HOXC6、HOXB4、HOXB6基因表達的情況，并且用全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）進行干擾，以觀察在此過程中ATRA對HOX基因表達的影響。 方法： 1．10例

2、臍血標(biāo)本由本院產(chǎn)房提供，取自正常足月順產(chǎn)新生兒斷臍后的胎盤段臍血。 2．實驗分組。實驗分2組：（1）正常組（normal）：不加全反式維甲酸，代之等量1640培養(yǎng)液加入基本培養(yǎng)體系。（2）維甲酸組（all-trans-retinoic acid，ATRA組）：加入ATRA稀釋液0．1ml，終濃度6×10-8mol/l。 3．采用造血干/祖細胞體外培養(yǎng)技術(shù)，以ATRA持續(xù)干擾人類造血干細胞，觀察正常組、維甲酸組的人類臍血H

3、SC經(jīng)植物血凝素（Phytohemagglutinin，PHA-M）誘導(dǎo)后，在培養(yǎng)過程第3天，7天和12天的CFU-TL集落生成情況。 4．采用瑞氏染色法鑒定CFU-TL集落細胞成分。 5．在第3天、第7天、第12天分別提取各組細胞總RNA，用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA分子的完整性。 6．通過隨機引物將各時間點提取到的兩組細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Fluorescen

4、ce Quantitative Real Time Polymerize Chain Reaction，F(xiàn)Q-RT-PCR）進行擴增并檢測臍血造血干細胞向淋巴系祖細胞增殖分化過程中兩組HOXC4、HOXC6、HOXB4、HOXB6基因的表達水平。 7．隨機抽取HOXC4、HOXC6、HOXB4、HOXB6基因通過電泳實驗分別獲得其在3天、7天、12天電泳圖。 8．統(tǒng)計方法：結(jié)果用DNA相對拷貝數(shù)和RNA表達相對量（2-△

5、△Ct）表示HOX4、HOXC6、HOXB4、HOXB6基因相對表達量，采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示HOXC4、HOXC6、HOXB4、HOXB6基因的變化情況。進行方差齊性檢驗，ONE-WAY方差分析，組間均數(shù)兩兩比較用LSD法。兩組間基因相對表達量比較采用配對設(shè)計t檢驗。由統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS15．0完成。 結(jié)果： 1．集落細胞的形態(tài)學(xué)鑒定，瑞．氏染色法證明所培養(yǎng)的是淋巴系細胞。 2．1%甲醛變性瓊脂糖凝膠

6、電泳顯示RNA電泳圖的5s，18s，28s三條帶型整齊，無明顯拖尾及彌散，說明RNA結(jié)構(gòu)完整，無明顯降解。 3．逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增目的基因HOXC4、HOXC6、HOXB4、HOXB6和內(nèi)參照GAPDH基因的cDNA的產(chǎn)物，與DNA分子Marker相比示擴增產(chǎn)物大小分別為：HOXC4為254個堿基（bp），HOXC6212bp，HOXB4138bp，HOXB6119bp，GAPDH基因為141bp，與預(yù)定理論值大小符合。

7、4．人臍血造血干細胞向淋巴系祖細胞增殖分化過程中，兩組細胞的HOX基因均有規(guī)律的表達，隨培養(yǎng)時間推移，正常組、ATRA組HOXC4、HOXC6，HOXB6基因均在增殖分化的第7天表達最強烈，第12天表達明顯降低，而HOXB4基因表達卻隨培養(yǎng)時間推移逐漸降低。 5．與正常組比較，HOXC4、HOXC6、 HOXB4、HOXB6基因均受ATRA（6×10-8mol/l）的上調(diào)。 結(jié)論： 1．HOXC4、HOXC6、H