自體臍帶血血清培養(yǎng)人羊膜間充質干細胞的初步研究.pdf

1、目的：初步探討自體臍帶血血清（humanumbilicalcordbloodserum，hCBS）培養(yǎng)對人羊膜間充質干細胞（humanamnioticmesenchymalstemcells，hAMSCs）增殖、表面分子和某些特征性蛋白表達的影響，為hAMSCs用于細胞治療提供優(yōu)化的培養(yǎng)體系奠定基礎。方法：采用胰蛋白酶-膠原酶分離法分離hAMSCs，運用差速貼壁和傳代培養(yǎng)純化hAMSCs，制各自體hCBS，用10％hCBS加LG-DME

2、M培養(yǎng)基培養(yǎng)hAMSCs，觀察原代和傳至1-3代培養(yǎng)的hAMSCs生長情況；流式細胞儀分析hAMSCs的表型和細胞周期；臺盼藍拒染法計數(shù)活細胞，繪制hAMSCs生長曲線；RTreal-timePCR檢測波形蛋白、CK18、Alb、AFP、Oct-4和NanogmRNA表達，HE染色觀察細胞形態(tài)學變化；免疫細胞化學觀察波形蛋白、CK18、Alb的蛋白表達。結果：hCBS原代培養(yǎng)hAMSCs，48h貼壁，hAMSCs培養(yǎng)5d，細胞融合達80

3、％以上。hAMSCs傳代培養(yǎng)，24h內貼壁，每3d換液1次，傳代的細胞生長曲線呈S型，于第3-6d處于指數(shù)生長期，平均倍增時間為32h。流式細胞術檢測顯示，第3代hAMSCs的細胞周期主要集中于G0-G1期，細胞增殖指數(shù)為（24.8±4.3）％。第1至第3代hAMSCs均表達CD44+、CD29+、CD73+和CD166+，而基本不表達CD34和CD45；與第1代比，第2-3代hAMSCs表達CD44+、CD29+細胞數(shù)有增加趨勢。RT

4、real-timePCR檢測顯示，第3代hAMSCs高表達波形蛋白和AFPmRNA，低表達Alb、CK18mRNA，同時還有Oct-4和NanogmRNA的表達。免疫細胞化學染色和蘇木素復染，顯微鏡下觀察顯示，第3代hAMSCs純度較高，高表達波形蛋白，低表達Alb和CK18蛋白。結論：新建立的hCBS培養(yǎng)體系由LG-DMEM和10％hCBS組成，可用于hAMSCs的培養(yǎng)，能較好地保持hAMSCs的增殖能力，維持其干細胞的細胞周期分布的