HIV-1 AE重組型包膜蛋白疫苗構(gòu)建及免疫原改造和免疫策略研究.pdf

1、人免疫缺陷病毒Ⅰ型（Human Immunodeficiency Virus Type I，HIV-1）感染可以導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合癥（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），即艾滋病。艾滋病已成為有史以來(lái)最具破壞性的傳染病之一：目前全球共存活艾滋病病毒感染者和病人（HIV/AIDS）約3340萬(wàn)人（約占總?cè)丝诘?.6％），在中國(guó)這個(gè)數(shù)字也有是74萬(wàn)，且2009年當(dāng)年中國(guó)新發(fā)艾滋病病毒感染者就

2、有4.8萬(wàn)人。HIV-1一旦感染，便很難被機(jī)體清除；結(jié)合歷史上多次傳染病控制經(jīng)驗(yàn)，研發(fā)有效安全的疫苗將是控制HIV-1大規(guī)模流行的最佳途徑。流行病學(xué)調(diào)查顯示我國(guó)HIV-1最主要的流行亞型或流行重組型是CRF07 BC，CRF08 BC，B’（泰國(guó)B）和CRf01_AE。其中AE重組型病毒主要通過(guò)性接觸途徑傳播，而性接觸是已成為我國(guó)新發(fā)感染的主要途徑，伴隨這一情況，AE重組型在新發(fā)感染中的比例也呈逐年上升的態(tài)勢(shì)。因此研發(fā)針對(duì)HIV-1 A

3、E重組型的預(yù)防性疫苗，對(duì)于控制我國(guó)HIV-1的傳播有重要意義。
　　 包膜蛋白是設(shè)計(jì)HV-1抗體疫苗時(shí)選擇的主要免疫原。但是，天然的HIV-1包膜蛋白由于高度糖基化導(dǎo)致一些保守抗原表位遮蔽，因而天然HIV-1膜蛋白難于有效地活化廣譜中和抗體。有研究顯示，通過(guò)對(duì)包膜蛋白糖基化位點(diǎn)的修飾改造可以消除這些不利因素，提高HIV-1膜蛋白活化中和抗體的能力。所以在本研究的第一部分，我們構(gòu)建了表達(dá)HIV-1 AE重組型膜蛋白gp140的DN

4、A疫苗，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)定點(diǎn)突變方法分別突變了gp140 V1/V3的157/161和V4區(qū)的382/388糖基化位點(diǎn)，并構(gòu)建成相應(yīng)DNA疫苗m157/161和m157/161。Western Blot結(jié)果顯示，改造前后的質(zhì)粒均可以高效表達(dá)目的蛋白，其中包括大量以分泌形式存在的蛋白；改造對(duì)蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯影響。
　　 為了評(píng)價(jià)上述幾種DNA疫苗活化的免疫反應(yīng)特征，我們用所構(gòu)建的DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠4次，最后一次免疫兩周后

5、處死小鼠進(jìn)行檢測(cè)。基于IFN-γ檢測(cè)的ELISPOT實(shí)驗(yàn)顯示，gp140免疫組小鼠的特異性T細(xì)胞反應(yīng)為（2432±586）SFCs/106脾細(xì)胞，m157/161組為（2682±893）SFCs/106脾細(xì)胞，m382/388組為（2360±560）SFCs/106脾細(xì)胞，各實(shí)驗(yàn)組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明疫苗可以活化高水平T細(xì)胞反應(yīng)，且糖基化改造對(duì)疫苗活化的特異性T細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度沒(méi)有顯著影響。EIASA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠血清中的結(jié)合抗體，結(jié)果顯示，

6、gp140組平均抗體滴度是4800，m157/161組是1600，m382/388組是1200。兩個(gè)糖基化改造組顯著低于未改造組，p<0.02。說(shuō)明糖基化位點(diǎn)突變后，膜蛋白疫苗活化結(jié)合抗體反應(yīng)的能力明顯下降。
　　 最后，用體外中和實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠血清對(duì)3株B'/C重組型HIV-1臨床分離株（XBC6371，XBC0793和XBC6431）的中和能力。數(shù)據(jù)顯示：對(duì)XBC6371和XBC6431病毒株，gp140免疫組的血清幾乎沒(méi)有中

7、和作用，m157/161和m382/388組有個(gè)別小鼠出現(xiàn)6％～16％的中和活性；中和XBC0793病毒時(shí)，m157/161組平均病毒抑制率為47％，顯著高于gp140免疫組（17.7％），p=0.023；m382/388平均病毒抑制率為49％，也顯著高于gp140免疫組，p=0.013。說(shuō)明157/161和382/388位點(diǎn)的糖基化改造可以提高HIV-1AE亞型gp140疫苗中和異源型別病毒能力，并且中和活性的提高并不是因?yàn)榻Y(jié)合抗體的

8、活化導(dǎo)致的。這部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了可以有效活化結(jié)合抗體和T細(xì)胞反應(yīng)的AE亞型膜蛋白疫苗；本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)的糖基化位點(diǎn)改造方案為增強(qiáng)HIV膜蛋白疫苗活化中和抗體能力提供了一定思路。后續(xù)應(yīng)選擇更多不同來(lái)源病毒株對(duì)其中和能力進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，其中和能力提高的原因也需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。
　　 另一方面，合適的載體是提高疫苗效果的有效途徑之一。經(jīng)過(guò)多年臨床使用的、安全性好的復(fù)制型痘苗病毒載體疫苗將是艾滋病載體疫苗未來(lái)發(fā)展的主流方向之一。

9、相對(duì)于DNA疫苗或痘病毒疫苗單獨(dú)免疫，DNA初免.痘病毒加強(qiáng)策略可以提高免疫原的免疫原性，并且避免了加強(qiáng)針對(duì)載體的免疫反應(yīng)。因而本研究第二部分中，我們構(gòu)建了表達(dá)HIV-1 AE亞型包膜蛋白的復(fù)制型天壇株痘苗病毒載體疫苗，并使用DNA疫苗初免/痘苗病毒加強(qiáng)策略，在小鼠模型評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果。以往研究發(fā)現(xiàn)，包膜蛋白去除胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)的截短型gp140作為可分泌抗原，可以活化高水平的抗體反應(yīng)；而保留跨膜區(qū)，僅去除胞內(nèi)區(qū)的另一種截短型包膜蛋白g

10、p145被證明相對(duì)gp140可以更好的活化T細(xì)胞反應(yīng)。我們?cè)O(shè)想，在DNA初免/痘苗病毒加強(qiáng)策略下，用gp140和gp145先后免疫同一個(gè)體是否可以同時(shí)活化高水平的T細(xì)胞反應(yīng)和抗體反應(yīng)?于是在第二部分研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了gp140和gp145疫苗異源交叉初免/加強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)方案，即用一種截短型膜蛋白DNA免疫3次后，用另一種截短型膜蛋白重組痘苗病毒加強(qiáng)免疫1次，以探討不同免疫方案活化的免疫效果，并選擇最優(yōu)方案。
　　 我們首先用ELIS

11、A實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了疫苗活化的結(jié)合抗體，結(jié)果顯示gp140DNA-gp140痘苗免疫組和gp140DNA-gp145痘苗免疫組活化了很高的抗體反應(yīng)，滴度的幾何平均值分別為12800和19401；而gp145 DNA-gp145痘苗免疫組和gp145DNA-gp140痘苗免疫組活化的結(jié)合抗體滴度的幾何平均值分別只有566和606。本結(jié)果證實(shí)了gp140初免活化抗體的能力高于gp145初免；同時(shí)發(fā)現(xiàn)在本免疫策略下，初免選擇的DNA免疫原類型主要

12、決定了小鼠最終的抗體滴度。接著我們用基于IFN-γ檢測(cè)的ELISPOT實(shí)驗(yàn)方法評(píng)價(jià)了各實(shí)驗(yàn)組活化的特異性T細(xì)胞反應(yīng)水平。結(jié)果顯示，gp145疫苗初免加強(qiáng)組活化的T細(xì)胞反應(yīng)（（3424±650）SFCs/106脾細(xì)胞），高于gp140疫苗初免/加強(qiáng)組（（1918±442）SFCs/106脾細(xì)胞）。并且，gp140 DNA初免的小鼠，用gp145痘苗異源加強(qiáng)可以活化比用gp140加強(qiáng)更高一些的T細(xì)胞反應(yīng)；同樣，用gp145 DNA初免的小鼠

13、，用gp145加強(qiáng)也比用gp140加強(qiáng)活化的T細(xì)胞反應(yīng)略高。這部分?jǐn)?shù)據(jù)說(shuō)明，相對(duì)于gp140，gp145無(wú)論用做初免還是加強(qiáng)，都可以更好的活化T細(xì)胞反應(yīng)。結(jié)合以上兩部分?jǐn)?shù)據(jù)可以看出，gp140 DNA初免/gp145痘苗病毒加強(qiáng)是可以同時(shí)活化高水平的T細(xì)胞反應(yīng)和結(jié)合抗體反應(yīng)的免疫方案。
　　 為了深入了解該疫苗活化的T細(xì)胞反應(yīng)特征，本部分進(jìn)一步研究了AE亞型膜蛋白疫苗在BALB/c（H-2d）小鼠模型上的T細(xì)胞表位分布，用肽庫(kù)作

14、圖篩選法，我們定位到幾個(gè)可以活化相對(duì)較強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)的肽表位：35號(hào)肽（NSNNTTNGPNKIGNI）、16號(hào)肽（ETEVHNVWATHACVP）、136號(hào)肽（QQQSNLLRAIEAQQH）和106號(hào)肽（GQAMYAPPISGRINC）。其中，第35號(hào)肽是一個(gè)很強(qiáng)的T細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位，針對(duì)這個(gè)表位的T細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度占到總T細(xì)胞反應(yīng)的61.3％。針對(duì)以上幾個(gè)肽表位的T細(xì)胞反應(yīng)占總T細(xì)胞反應(yīng)的81.7％，說(shuō)明本疫苗在BALB/c小鼠體內(nèi)活化

15、的T細(xì)胞免疫反應(yīng)主要集中于幾個(gè)優(yōu)勢(shì)表位上。經(jīng)過(guò)與Los Alamos HIV數(shù)據(jù)庫(kù)和其他研究文章的比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)定位到的35號(hào)肽表位為本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)到的H-2d限制性T細(xì)胞表位。該研究將為評(píng)價(jià)HIV疫苗在H-2d型遺傳背景下的免疫效果提供數(shù)據(jù)支持。本研究也存在一定的局限之處，期待對(duì)本研究的疫苗和免疫策略在非人靈長(zhǎng)類大動(dòng)物模型的進(jìn)一步評(píng)價(jià)及對(duì)其活化中和抗體能力的進(jìn)一步評(píng)價(jià)；也提示了開(kāi)發(fā)可以活化針對(duì)更多表位，尤其是保守表位的T細(xì)胞反應(yīng)