DRAM基因?qū)ξ赴㏒GC7901細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響.pdf

1、目的:(1)構(gòu)建p53基因下游的損傷調(diào)節(jié)自噬調(diào)控基因(damage-regulated autophagymodulator,DRAM)過表達(dá)腺病毒載體(Admax-pDC315-DRAM-EGFP)。(2)Admax-pDC315-DRAM-EGFP轉(zhuǎn)染人中分化胃癌SGC7901細(xì)胞,觀察DRAM基因?qū)ξ赴㏒GC7901細(xì)胞增殖、自噬及凋亡的影響。
　　 方法:(1)從cDNA文庫中,利用PCR方法獲取目的基因DRAM序列。將

2、目的基因與真核表達(dá)載體pDC315-EGFP分別用EcoR I進(jìn)行酶切,酶切產(chǎn)物電泳回收后進(jìn)行定向連接,其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞。細(xì)胞克隆先行菌落PCR鑒定,再對PCR鑒定陽性克隆進(jìn)行測序和比對分析,比對正確即為構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒pDC315-DRAM-EGFP,將其再與輔助包裝質(zhì)粒pBHGF35共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,同源重組,包裝擴增得到重組腺病毒Admax-pDC315-DRAM-EGFP。利用293細(xì)胞擴增病毒并進(jìn)行純化,測定純化后病

3、毒滴度,選擇最佳感染復(fù)數(shù)并測定其對胃癌SGC7901細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。(2)Admax-pDC315-DRAM-EGFP轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細(xì)胞,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,采用MTT法測定SGC7901細(xì)胞增殖的受抑情況；應(yīng)用LC3免疫熒光標(biāo)記法觀察胃癌SGC7901細(xì)胞中自噬特異性蛋白LC3的分布和表達(dá)變化；采用Western-blot檢測胃癌SGC7901細(xì)胞中p53、Bcl-2、beclin-1蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:(

4、1)酶切、連接產(chǎn)物基因測序結(jié)果與目的序列完全吻合,表明DRAM基因正確插入真核表達(dá)載體pDC315-EGFP。構(gòu)建的能轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞的重組腺病毒Admax-pDC315-DRAM-EGFP純化后滴度達(dá)2.8x109 IU/ml。當(dāng)感染復(fù)數(shù)(MOI)達(dá)60時轉(zhuǎn)染效率最大,此時腺病毒對SGC7901細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(綠色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))為93±5.4％。(2)重組腺病毒轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞后:隨著時間的延長,對癌細(xì)胞增殖的抑制

5、作用逐漸增強(40μl Admax-pDC315-DRAM-EGFP在作用24h、48h、72h時,對細(xì)胞增殖的抑制率分別為12.69±2.43％,38.49±1.31％和69.15±2.50％,與陰性對照組相比,都有顯著性差異(P<0.05))；隨時間的延長,細(xì)胞內(nèi)自噬特異性蛋白LC3的表達(dá)逐漸增強,且分布呈彌散趨勢；用SigmaScan Pro5軟件對Western Blot結(jié)果圖像進(jìn)行采集計算,空白組、陰性對照組、重組腺病毒轉(zhuǎn)染2

6、4h組和重組腺病毒轉(zhuǎn)染48h組p53蛋白表達(dá)水平分別為:1912416、2614012、3272305、4982792,相對比值為:1/1.37/1.71/2.61；beclin-1表達(dá)水平分別為678110、593149、1149591、987640,相對比值為:1/0.87/1.70/1.46；bcl-2蛋白表達(dá)水平分別為362689、346132、227493、160150,相對比值為:1/0.95/0.63/0.44。