磁性人工抗原提呈細胞微孔反應板的研制及抗原特異性T細胞數量和反應活性的檢測.pdf

1、抗原特異性T淋巴細胞(Antigen-Specific T cell，AST)是介導適應性免疫應答的核心細胞，在抗感染、抗腫瘤、超敏反應、自身免疫病以及移植排斥中都起著至關重要的作用，其數量的多寡和功能的強弱能直接反映人體特異性細胞免疫的功能狀態(tài)。但是，與特異性抗體的檢測相比，抗原特異性T細胞的數量和功能檢測都困難許多，方法少而復雜。目前pMHC多聚體熒光染色加流式細胞分析技術是抗原特異性T細胞數量檢測的金標準。但由于多聚體制備技術復雜

2、，商品化產品種類少，且昂貴，不呈系列，限制了其廣泛應用。針對抗原特異性T細胞數量和功能的檢測，無論是普遍應用的酶聯(lián)免疫斑點法或細胞內細胞因子染色法，還是pMHC多聚體流式染色法以及新近出現的pMHC芯片法和人工抗原提呈細胞芯片技術等，各有其優(yōu)勢和缺陷，每種方法單獨應用于T細胞的檢測都不能簡單快速地同步進行細胞數量和功能的分析。因此創(chuàng)建一種簡單易行、可同步對抗原特異性T細胞進行數量和反應活性檢測的新方法成為一個新的探索方向。
　　為

3、此，本研究利用商品化的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體作為靶向抗原，包被在直徑4.5微米的磁珠表面制成磁珠式人工抗原提呈細胞(aAPC-beads)，以OT-1轉基因鼠脾淋巴細胞群中的OVA抗原特異性T細胞作為待檢的靶細胞，建立了磁性人工抗原提呈細胞微孔反應板技術（aAPC-microplate），優(yōu)化了實驗方案，并著重進行了方法學論證。該技術的基本方案是:將aAPC-beads與OT-1鼠脾淋巴細胞以1∶1的比例接種在已包

4、被有抗IFN-γ抗體的透明酶聯(lián)免疫斑點微孔板（ELISPOT板）中共孵育2小時，然后在96孔板式磁場的作用下分選與磁珠結合的OVA抗原特異性T細胞，光鏡下計數分選所得細胞數，計算其占接種的淋巴細胞數的比例;繼而在分選孔中加入抗原性刺激物，置細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時，激發(fā)OVA抗原特異性T細胞活化并分泌細胞因子，最后用ELSIPOT技術檢測分泌IFN-γ的細胞，計數斑點數，計算分選所得細胞群中有反應活性的細胞比例。
　　另外，由

5、于商業(yè)化二聚體H-2Kb-Ig/dimer價格昂貴，且我們后續(xù)實驗必須用自制的多聚體進行方法學論證，故我們用OVA257-264抗原肽、β2m、H-2Kbα鏈胞外區(qū)以及Avi標簽和His6標簽重組成單鏈融合基因，構建重組質粒，進而進行表達、提取和純化制備SCT復合物。
　　本論文的主要結果如下:
　　1、aAPC-microplate優(yōu)化方案（CD8+T細胞預分選）檢測OVA抗原特異性T細胞的數量時，每個待檢細胞樣品設5個檢

6、測數量組，每個細胞數量組設置3個復孔，每個數量組的陽性細胞數由復孔的平均值表示，最終的陽性細胞比例由5個檢測數量組的直線回歸方程校正得出。方法學的準確性分析顯示:磁珠分選所得細胞數與接種的淋巴細胞數之間呈現了良好的數量依賴關系和線性關系，R2值達到0.99以上。5只OT-1鼠脾淋巴細胞群中OVA抗原特異性T細胞的比例分別為11.27％、9.40％、12.62％、14.77％和21.85％;經典的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚

7、體熒光染色及流式分析結果分別為13.69％、10.13％、16.88％、16.77％和21.45％。兩組數據間無統(tǒng)計學差異，相關系數為0.9280;PE-anti-mouse TCR Vα2熒光染色及流式分析結果分別為15.94％、18.23％、32.08％、31.29％和42.88％，明顯高于H-2Kb-Ig/OVA27-264二聚體熒光染色結果和aAPC-microplate檢測法結果，差異顯著(p＜0.05)，相關系數分別為0.8

8、540和0.8054。特異性分析顯示:用無關抗原肽的Kb/TRP2-beads同步分選OT-1鼠脾淋巴細胞群時，陽性細胞比例則降為0.45％左右;經Kb/OVA-beads磁珠分選后所得細胞群中的OVA抗原特異性T細胞比例經H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體熒光染色及流式分析為84.48％和89.80％（兩次實驗結果），而分選前的比例為13.69％和10.13％。重復性分析顯示:在5個檢測數量組之間，陽性細胞比例的平均批內CV

9、值為4.4％;對同一份OT-1鼠脾淋巴細胞群進行三次重復實驗時，批間CV值為13.5％，陽性細胞比例分別為9.40％、9.77％和9.47％;R2值分別為0.9959、0.9970和0.9960。上述結果顯示aAPC-microplate優(yōu)化方案具有較高的特異性、準確性和重復性以及與傳統(tǒng)檢測方法的相關性，提示了該技術檢測抗原特異性T細胞數量的可行性。
　　2、aAPC-microplate優(yōu)化方案同步檢測OVA抗原特異性T細胞的數

10、量和反應活性時，經過磁珠分選和計數后，兩只OT-1鼠脾淋巴細胞群中OVA特異性T細胞比例為12.62％和21.85％，與經典的pMHC二聚體熒光染色法的結果(16.88％和21.45％)相近。在3種不同形式和性質的刺激物中，PHA刺激OVA抗原特異性T細胞活化并分泌IFN-γ的能力最強，反應活性比達59.91-63.99％;其它兩種刺激劑（磁珠式aAPC-beads，游離的OVA多肽+anti-CD28）的刺激能力次之，反應活性比在45

11、.14-54.35％，且相互間差異不顯著。這提示了aAPC-microplate技術在評價抗原特異性T細胞活性功能方面的可行性。
　　3、通過PCR技術將兩個寡核苷酸接頭(Linker)與OVA257-264抗原肽、β2m、H-2Kbα鏈胞外區(qū)以及Avi標簽和His6標簽重組成單鏈融合基因，成功構建了重組質粒，在BL21菌中表達、提取和純化了H-2Kb/OVA單鏈三聚體包涵體蛋白(SCT)，并在體外通過稀釋復性法折疊成H-2Kb/

12、OVA SCT復合單體，通過生物素-親和素系統(tǒng)制備了PE標記的H-2Kb/OVA SCT四聚體。將H-2Kb/OVA SCT復合單體包被細胞大小的磁珠后用H-2Kb分子構象特異性單抗進行熒光染色和流式分析，驗證了折疊后的H-2Kb/OVA SCT復合單體在磁珠表面具有正確的空間構象和定向;利用PE-H-2Kb/OVA SCT四聚體對OT-1鼠脾淋巴細胞進行熒光染色和流式分析，檢測OVA抗原特異性T細胞的比例(19.90％)，并與商品化的