磁性人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板的研制及抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量和反應(yīng)活性的檢測(cè).pdf

1、抗原特異性T淋巴細(xì)胞(Antigen-Specific T cell，AST)是介導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的核心細(xì)胞，在抗感染、抗腫瘤、超敏反應(yīng)、自身免疫病以及移植排斥中都起著至關(guān)重要的作用，其數(shù)量的多寡和功能的強(qiáng)弱能直接反映人體特異性細(xì)胞免疫的功能狀態(tài)。但是，與特異性抗體的檢測(cè)相比，抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量和功能檢測(cè)都困難許多，方法少而復(fù)雜。目前pMHC多聚體熒光染色加流式細(xì)胞分析技術(shù)是抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于多聚體制備技術(shù)復(fù)雜

2、，商品化產(chǎn)品種類少，且昂貴，不呈系列，限制了其廣泛應(yīng)用。針對(duì)抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量和功能的檢測(cè)，無(wú)論是普遍應(yīng)用的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法或細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法，還是pMHC多聚體流式染色法以及新近出現(xiàn)的pMHC芯片法和人工抗原提呈細(xì)胞芯片技術(shù)等，各有其優(yōu)勢(shì)和缺陷，每種方法單獨(dú)應(yīng)用于T細(xì)胞的檢測(cè)都不能簡(jiǎn)單快速地同步進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量和功能的分析。因此創(chuàng)建一種簡(jiǎn)單易行、可同步對(duì)抗原特異性T細(xì)胞進(jìn)行數(shù)量和反應(yīng)活性檢測(cè)的新方法成為一個(gè)新的探索方向。
　　為

3、此，本研究利用商品化的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體作為靶向抗原，包被在直徑4.5微米的磁珠表面制成磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞(aAPC-beads)，以O(shè)T-1轉(zhuǎn)基因鼠脾淋巴細(xì)胞群中的OVA抗原特異性T細(xì)胞作為待檢的靶細(xì)胞，建立了磁性人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板技術(shù)（aAPC-microplate），優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)方案，并著重進(jìn)行了方法學(xué)論證。該技術(shù)的基本方案是:將aAPC-beads與OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞以1∶1的比例接種在已包

4、被有抗IFN-γ抗體的透明酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)微孔板（ELISPOT板）中共孵育2小時(shí)，然后在96孔板式磁場(chǎng)的作用下分選與磁珠結(jié)合的OVA抗原特異性T細(xì)胞，光鏡下計(jì)數(shù)分選所得細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其占接種的淋巴細(xì)胞數(shù)的比例;繼而在分選孔中加入抗原性刺激物，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，激發(fā)OVA抗原特異性T細(xì)胞活化并分泌細(xì)胞因子，最后用ELSIPOT技術(shù)檢測(cè)分泌IFN-γ的細(xì)胞，計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)，計(jì)算分選所得細(xì)胞群中有反應(yīng)活性的細(xì)胞比例。
　　另外，由

5、于商業(yè)化二聚體H-2Kb-Ig/dimer價(jià)格昂貴，且我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)必須用自制的多聚體進(jìn)行方法學(xué)論證，故我們用OVA257-264抗原肽、β2m、H-2Kbα鏈胞外區(qū)以及Avi標(biāo)簽和His6標(biāo)簽重組成單鏈融合基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，進(jìn)而進(jìn)行表達(dá)、提取和純化制備SCT復(fù)合物。
　　本論文的主要結(jié)果如下:
　　1、aAPC-microplate優(yōu)化方案（CD8+T細(xì)胞預(yù)分選）檢測(cè)OVA抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量時(shí)，每個(gè)待檢細(xì)胞樣品設(shè)5個(gè)檢

6、測(cè)數(shù)量組，每個(gè)細(xì)胞數(shù)量組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)數(shù)量組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)由復(fù)孔的平均值表示，最終的陽(yáng)性細(xì)胞比例由5個(gè)檢測(cè)數(shù)量組的直線回歸方程校正得出。方法學(xué)的準(zhǔn)確性分析顯示:磁珠分選所得細(xì)胞數(shù)與接種的淋巴細(xì)胞數(shù)之間呈現(xiàn)了良好的數(shù)量依賴關(guān)系和線性關(guān)系，R2值達(dá)到0.99以上。5只OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群中OVA抗原特異性T細(xì)胞的比例分別為11.27％、9.40％、12.62％、14.77％和21.85％;經(jīng)典的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚

7、體熒光染色及流式分析結(jié)果分別為13.69％、10.13％、16.88％、16.77％和21.45％。兩組數(shù)據(jù)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，相關(guān)系數(shù)為0.9280;PE-anti-mouse TCR Vα2熒光染色及流式分析結(jié)果分別為15.94％、18.23％、32.08％、31.29％和42.88％，明顯高于H-2Kb-Ig/OVA27-264二聚體熒光染色結(jié)果和aAPC-microplate檢測(cè)法結(jié)果，差異顯著(p＜0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為0.8

8、540和0.8054。特異性分析顯示:用無(wú)關(guān)抗原肽的Kb/TRP2-beads同步分選OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群時(shí)，陽(yáng)性細(xì)胞比例則降為0.45％左右;經(jīng)Kb/OVA-beads磁珠分選后所得細(xì)胞群中的OVA抗原特異性T細(xì)胞比例經(jīng)H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體熒光染色及流式分析為84.48％和89.80％（兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果），而分選前的比例為13.69％和10.13％。重復(fù)性分析顯示:在5個(gè)檢測(cè)數(shù)量組之間，陽(yáng)性細(xì)胞比例的平均批內(nèi)CV

9、值為4.4％;對(duì)同一份OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，批間CV值為13.5％，陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為9.40％、9.77％和9.47％;R2值分別為0.9959、0.9970和0.9960。上述結(jié)果顯示aAPC-microplate優(yōu)化方案具有較高的特異性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性以及與傳統(tǒng)檢測(cè)方法的相關(guān)性，提示了該技術(shù)檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量的可行性。
　　2、aAPC-microplate優(yōu)化方案同步檢測(cè)OVA抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)

10、量和反應(yīng)活性時(shí)，經(jīng)過(guò)磁珠分選和計(jì)數(shù)后，兩只OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群中OVA特異性T細(xì)胞比例為12.62％和21.85％，與經(jīng)典的pMHC二聚體熒光染色法的結(jié)果(16.88％和21.45％)相近。在3種不同形式和性質(zhì)的刺激物中，PHA刺激OVA抗原特異性T細(xì)胞活化并分泌IFN-γ的能力最強(qiáng)，反應(yīng)活性比達(dá)59.91-63.99％;其它兩種刺激劑（磁珠式aAPC-beads，游離的OVA多肽+anti-CD28）的刺激能力次之，反應(yīng)活性比在45

11、.14-54.35％，且相互間差異不顯著。這提示了aAPC-microplate技術(shù)在評(píng)價(jià)抗原特異性T細(xì)胞活性功能方面的可行性。
　　3、通過(guò)PCR技術(shù)將兩個(gè)寡核苷酸接頭(Linker)與OVA257-264抗原肽、β2m、H-2Kbα鏈胞外區(qū)以及Avi標(biāo)簽和His6標(biāo)簽重組成單鏈融合基因，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒，在BL21菌中表達(dá)、提取和純化了H-2Kb/OVA單鏈三聚體包涵體蛋白(SCT)，并在體外通過(guò)稀釋復(fù)性法折疊成H-2Kb/

12、OVA SCT復(fù)合單體，通過(guò)生物素-親和素系統(tǒng)制備了PE標(biāo)記的H-2Kb/OVA SCT四聚體。將H-2Kb/OVA SCT復(fù)合單體包被細(xì)胞大小的磁珠后用H-2Kb分子構(gòu)象特異性單抗進(jìn)行熒光染色和流式分析，驗(yàn)證了折疊后的H-2Kb/OVA SCT復(fù)合單體在磁珠表面具有正確的空間構(gòu)象和定向;利用PE-H-2Kb/OVA SCT四聚體對(duì)OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行熒光染色和流式分析，檢測(cè)OVA抗原特異性T細(xì)胞的比例(19.90％)，并與商品化的