重組人促紅細胞生成素對大鼠頸脊髓亞急性壓迫性損傷神經保護作用的實驗研究.pdf

1、第一部分大鼠頸脊髓亞急性壓迫性損傷實驗模型的建立
　　 目的:構建大鼠頸脊髓亞急性壓迫性損傷的動物模型，并通過行為學評分、組織學染色等方法對該模型進行評價。
　　 方法:清潔級雌性Wistar大鼠60只，隨機分為兩組：假手術組(A組，n=30)，每個時間點6只，只行椎板切除術不作頸脊髓壓迫操作；脊髓亞急性壓迫組(B組，n=30)，每個時間點6只，制作頸脊髓亞急性壓迫性損傷的模型。分別在術后3d，7d，14d，21d，28

2、d時間點，用BBB評分評價四肢運動功能；在兩組中隨機選取2只大鼠，行脊柱側位X線檢查，觀察壓迫裝置與脊柱間的相對位置關系，壓迫裝置是否松動、移位或脫落，并了解頸脊髓受壓迫的程度。將頸脊髓做病理切片，行HE染色，觀察頸髓損傷病變的情況。
　　 結果:實驗結果顯示，部分大鼠于術后24h內出現癱瘓，考慮為急性損傷所致，少數大鼠死亡，舍棄上述兩類，并重新造模補齊。亞急性損傷的大鼠則在7d后逐漸出現癱瘓，其身體僵硬程度輕或軟癱，前爪輕度掌

3、曲，尚能爬動和進食，膀胱充盈但未失禁或癃閉。大部分模型僅見動作遲緩，未出現畸形和異常體位。肢體運動功能的評估結果示：在3、7d時間點，兩組間BBB評分相比較差異無統計學意義；14d，A組和B組評分相比，差異有統計學意義；21、28d，A組和B組分別評分相比，差異有統計學意義。大鼠脊柱側位X線示：頸脊髓壓迫裝置在其頸椎內固定位置較好，壓迫螺釘正好與脊髓外膜相接觸，進而造成頸脊髓壓迫；行大鼠頸椎過伸過屈側位片，未見脊髓壓迫裝置松動及脫落。H

4、E染色結果可見：低倍鏡下觀察，A組大鼠的頸脊髓表面未見擠壓痕跡，B組大鼠的頸脊髓表面都有不同程度的壓痕，并且受壓處的脊髓組織隨時間推移逐漸出現液化壞死，瘢痕化。高倍鏡下觀察，A組大鼠的頸脊髓神經元細胞形態(tài)正常，胞膜、核膜染色清晰，胞核位于細胞中央，大而圓，核染色質較少，弱嗜堿性染色呈淡藍色，核中央核仁顯色清楚，胞漿呈弱酸性染色呈淡紅色，伴有較多突起。B組大鼠的頸脊髓可見神經元細胞腫脹明顯、甚至出現空泡，胞核濃縮深染、核溶解，核固縮，結構

5、消失，血管周圍間隙增寬，神經軸索周圍間隙增寬，白質呈疏網狀改變；隨頸髓受壓時間延長，術后14、21、28d，鏡下可見胞質濃縮、核固縮深染等明顯改變，并伴有神經元細胞數目的減少及神經膠質細胞的增生。
　　 結論:本實驗成功構建大鼠頸脊髓亞急性壓迫性損傷的動物模型，并對模型進行系統的行為學評分及相關的病理學檢查，證實是本實驗的模型為一個較理想模擬亞急性壓迫性頸脊髓損傷的動物試驗模型。
　　 第二部分促紅細胞生成素及其受體在大

6、鼠頸脊髓組織中的表達
　　 目的:本實驗旨在闡述頸脊髓亞急性壓迫性損傷后EPO及EPO-R的表達及時間分布規(guī)律，及rhEPO對動物模型的治療作用。
　　 方法:清潔級雌性Wistar大鼠80只，隨機分為四組：假手術對照組(A組，n=5)，只行椎板切除術不作頸脊髓壓迫操作；生理鹽水對照組(B組，n=25)：建模術后7d靜脈推注給予生理鹽水1mL/d安慰治療；小劑量rhEPO治療組(C組，n=25)：建模術后7d靜脈推注給予

7、500 units/kg b.w.rhEPO治療；大劑量rhEPO治療組(D組，n=25)：建模術后7d靜脈推注給予5000units/kg b.w.rhEPO治療。在建模手術后，分別于第3、7、14、21、28d，采用Basso運動功能評分法，進行肢體運動功能的評分。BBB評分為22分制，觀察下肢沒有肌肉收縮或運動為0分，正常運動為21分；在動物完全清醒狀態(tài)下，通過觀察下肢活動和承重能力，對其肢體肌力進行評估。并于相應時間點，處死動物

8、，取出損傷節(jié)段頸脊髓，做石蠟切片并進行EPO及EPO-R的免疫組化染色。
　　 結果:肢體運動功能的評分結果，在3、7d時間點，各組間BBB評分相比，差異無統計學意義；14d，C組和D組分別與B組評分相比差異有統計學意義，21、28d，C組和D組分別與B組評分相比差異有顯著統計學意義；在各檢測時間點，C組和D組評分無統計學差異。A組：正常大鼠頸脊髓內EPO陽性細胞的均數為10.6±2.5，EPO-R陽性細胞均數為8.6±1.2，

9、均數在隨后的時間點無明顯改變。B組：損傷后3d，EPO陽性細胞的均數為10.2±2.9，EPO-R陽性細胞均數為9.5±1.7，與對照組相比，二者間統計學上無顯著性差異；手術后7d，EPO陽性細胞的均數為10.7±2.3，EPO-R陽性細胞均數為10.8±2.2，與對照組相比，二者統計學上無顯著性差異；手術后14d，EPO陽性細胞的均數明顯減少，計數為8.2±2.1，與對照組相比，二者間統計學上仍無顯著性差異，另一方面EPO-R陽性細胞

10、的均數反應性增多，計數達到26.31±6.3，與對照組相比，二者間統計學上存在顯著性差異，且均數值很高；手術后28d，EPO陽性細胞的均數為13.8±2.4，EPO-R陽性細胞均數為12.6±4.1，與對照組相比，二者間統計學上無顯著性差異。
　　 結論:EPO及EPO-R是一種內源性的神經保護系統，可能在神經損傷修復過程中具有重要的作用，脊髓損傷后EPO-R反應性增多，為外源性EPO提供靶點。頸脊髓亞急性壓迫性損傷后給予rhE

11、PO可取的良好的臨床治療效果。
　　 第三部分 rhEPO對大鼠頸脊髓亞急性壓迫性損傷后神經細胞凋亡的作用
　　 目的:本實驗研究不同劑量的重組人促紅細胞生成素(rhEPO)對大鼠頸脊髓亞急性壓迫性損傷后神經細胞凋亡的作用。
　　 方法:清潔級雌性Wistar大鼠80只，假手術對照組(A組，n=5)，只行椎板切除術不作頸脊髓壓迫操作；生理鹽水對照組(B組，n=25)：建模術后7d靜脈推注給予生理鹽水1mL/d安慰

12、治療；小劑量rhEPO治療組(C組，n=25)：建模術后7d靜脈推注給予500 units/kg b.w.rhEPO治療；大劑量rhEPO治療組(D組，n=25)：建模術后7d靜脈推注給予5000units/kg b.w.rhEPO治療。手術后分別于3、7、14、21、28d各時間點處死模型，取損傷的頸脊髓標本進行原位末端標記法(TUNEL)染色和流式細胞儀定量檢測細胞凋亡情況。
　　 結果:TUNEL標記陽性的細胞核被染成棕褐

13、色，胞漿復染為淡藍色。B組，7d，TUNEL染色陽性的細胞很少見；14d，在壓迫部位灰質中觀察到陽性細胞，包括頸髓前后角神經元；21d，壓迫節(jié)段的脊髓灰質發(fā)現大量的TUNEL陽性運動神經元細胞，并且伴有一些形態(tài)不確定的陽性小細胞；28d時仍有大量的陽性細胞，同21d相比數量沒有明顯差異。在C、D組，7、14d，脊髓僅發(fā)現很少的TUNEL陽性細胞；21d，運動神經元陽性細胞數量較B組明顯減少，且在28d在脊髓白質中甚至在脊髓后柱僅有很少T

14、UNEL陽性的細胞。B組凋亡細胞數量從14d開始明顯增加，在21d凋亡細胞數量達到峰值，并維持至28d仍有較多凋亡細胞數量。同C、D組相比，7d時，各組細胞數量沒有明顯差異；21d時，C組和D組神經細胞數量同B組相比差異有統計學意義。
　　 結論:rhEPO通過抑制亞急性壓迫性頸脊髓損傷后神經細胞的凋亡而起到神經保護作用，這為rhEPO用于亞急性頸脊髓壓迫性損傷的治療提供了理論依據，為臨床治療亞急性頸脊髓損傷提供了新的措施和思路

15、。
　　 第四部分 rhEPO對大鼠頸脊髓亞急性壓迫性損傷后炎性因子表達的作用
　　 目的:本試驗研究不同劑量的重組人促紅細胞生成素(rhEPO)對亞急性頸脊髓壓迫性損傷細胞因子表達的調節(jié)作用，旨在探討其對頸髓繼發(fā)性損傷作用的機制。
　　 方法:清潔級雌性Wistar大鼠80只，假手術對照組(A組，n=5)，只行椎板切除術不作頸脊髓壓迫操作；生理鹽水對照組(B組，n=25)：建模術后7d靜脈推注給予生理鹽水1mL

16、/d安慰治療；小劑量rhEPO治療組(C組，n=25)：建模術后7d靜脈推注給予500 units/kg b.w.rhEPO治療；大劑量rhEPO治療組(D組，n=25)：建模術后7d靜脈推注給予5000units/kg b.w.rhEPO治療。手術后分別于3、7、14、21、28d各個時間點處死模型，取損傷的頸脊髓標本，應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)定量檢測IL-8，TNF-a，IL-6和IL-1β的含量。
　　 結果:E

17、LISA結果：IL-8檢測示，術后3d，B、C、D組表達到達峰值，B組術后28d持續(xù)高表達；C，D組在術后21d表達顯著降低，尤其以D組降低為著；術后28d，C，D組表達顯著降低，同B組相比均具有顯著統計學意義。TNF-α結果示，術后第7d，B、C、D組表達到達峰值，B組術后28d表達持續(xù)降低，C，D組在術后14d表達顯著降低，術后28d，C，D組表達較21d時無顯著變化，同對照組相比均具有顯著意義。IL-6檢測示，術后第7d，B、C、

18、D組表達到達峰值，隨后各組表達顯著降低，D組在術后21d表達較對照組顯著降低，但是C組降低不明顯。術后28d，C，D組表達無明顯變化。IL-1β結果示，術后第3d，B、C、D組表達到達峰值，B組術后14d開始表達降低，C，D組在術后第7d開始表達顯著降低。術后21、28d，B、C、D組表達量無明顯差異。
　　 結論:頸脊髓亞急性壓迫性損傷后給予rhEPO能抑制多種細胞因子及趨化因子生成及表達，減輕損傷后炎癥反應，EPO在炎癥反應