小RNA-21通過PTEN-Akt信號介導了轉化生長因子-β引起的肝細胞上皮間質轉化.pdf

1、目的：
　　肝纖維化是以細胞外基質的過多沉積為特征，細胞外基質的主要來源是激活的肝星狀細胞。研究表明上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在其中也起著重要的作用。EMT是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，其標志為上皮標志蛋白表達下降和間皮標志蛋白的表達升高。小RNA(microRNA，miR)是一類長度約22～28個核苷酸的非編碼小分子RNA，其在轉錄后

2、水平和翻譯水平的基因調控過程中發(fā)揮重要作用，參與了許多生理病理過程的調節(jié)。我們的前期工作表明miR-21在肝星狀細胞激活過程中起著重要的作用。本研究的目的是探討miR-21在人肝細胞株(QSG-7701) EMT中的作用和機理。
　　方法：
　　1.TGF-β1對人肝細胞EMT的作用。
　　用10ng/mlTGF-β1刺激人肝細胞株QSG-7701細胞1、3、5、7天后，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，western bl

3、ot檢測上皮標志蛋白（E-鈣粘蛋白）和間皮標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)的表達。
　　2.TGF-β1刺激miR-21的表達。
　　用10ng/mlTGF-β1刺激人肝細胞株QSG-7701細胞1、3、5、7天后，real-timeRT-PCR檢測miR-21的表達。
　　3.MiR-21介導了TGF-β1對人肝細胞EMT作用。
　　轉染100nM miR-21抑制劑(miR-21 inhibitor)沉默m

4、iR-21后，TGF-β1刺激人肝細胞株QSG-77015天，轉染24小時后real-time RT-PCR檢測miR-21的表達。TGF-β1刺激5天后顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化。western blot檢測上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)和間皮標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)。
　　4.MiR-21對人肝細胞EMT的作用。
　　用100nMmiR-21模擬物(miR-21mimics)轉染人肝細胞株，24小時后用real-t

5、imeRT-PCR檢測miR-21的表達。3天后用顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化，用western blot檢測上皮標志蛋白（E-鈣粘蛋白）和間皮標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)。
　　5.PTEN/Akt通路介導了人肝細胞EMT
　　(1) TGF-β1刺激細胞后，western blot檢測PTEN。
　　(2)轉染miR-21模擬物和miR-21抑制劑后，western blot檢測PTEN。
　　(3)用5μ

6、M的Akt抑制劑(Akt inhibitorⅣ)預處理后，TGF-β1刺激細胞。用western blot檢測Akt磷酸化，上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)、間皮標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白）的表達。
　　(4)100nMmiR-21模擬物轉染人肝細胞株QSG-7701細胞后，加入5μM的Akt抑制劑(Akt inhibitorⅣ)，western blot檢測Akt磷酸化，上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)、間皮標志蛋白(N-鈣粘蛋白

7、、波形蛋白)的表達。
　　結果：
　　1.TGF-β1刺激引起了人肝細胞的EMT
　　(1) TGF-β1刺激引起了肝細胞形態(tài)改變，由原先多邊形的緊密排列的上皮樣細胞，變?yōu)榧氶L紡錘樣有較多觸角的成纖維細胞狀樣細胞。
　　(2) TGF-β1刺激引起了上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)表達下降。
　　(3) TGF-β1刺激引起了間質標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達上升。
　　2.TGF-β1刺激人肝細

8、胞miR-21的表達:在TGF-β1刺激5天后miR-21的表達明顯上升。
　　3.MiR-21介導了TGF-β1的EMT作用。
　　(1)轉染miR-21抑制劑24小時后，miR-21的表達明顯下降。
　　(2)形態(tài)改變:miR-21抑制劑組較對照組性狀更圓鈍，觸角更少，排列更緊密。
　　(3)上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)較對照組表達升高。
　　(4)間質標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達較對照組表達

9、下降。
　　以上結果提示下調miR-21表達后，阻斷了TGF-β1致肝細胞EMT作用。4.miR-21轉染直接刺激人肝細胞的EMT
　　(1)轉染miR-21模擬物24小時后，miR-21的表達明顯增高。
　　(2) miR-21模擬物轉染組細胞形態(tài)較對照組變瘦長，觸角更多，排列更松散。
　　(3) miR-21模擬物轉染組上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)較對照組表達下降。
　　(4) miR-21模擬物轉染組

10、間質標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達較對照組下降。
　　以上結果提示miR-21過表達可直接刺激人肝細胞的EMT
　　5.PTEN/Akt通路介導了人肝細胞的EMT作用
　　(1) TGF-β1調節(jié)了PTEN蛋白的表達:TGF-β1刺激細胞后PTEN表達下降。
　　(2) miR-21調節(jié)了PTEN蛋白的表達:轉染miR-21模擬物后PTEN表達下降，轉染miR-21抑制劑后PTEN表達上升。
　　(

11、3)抑制Akt減少了TGF-β1的EMT作用:Akt抑制劑+TGF-β1組較TGF-β1組上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)表達升高。間質標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達下降。
　　(4)抑制Akt減少了miR-21的EMT作用:Akt抑制劑+miR-21模擬物組較miR-21模擬物組上皮標志蛋白（E-鈣粘蛋白）表達升高，間質標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達下降。
　　結論：
　　MiR-21通過PTEN/Akt