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文檔簡介
1、目的:
肝纖維化是以細胞外基質的過多沉積為特征,細胞外基質的主要來源是激活的肝星狀細胞。研究表明上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在其中也起著重要的作用。EMT是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程,其標志為上皮標志蛋白表達下降和間皮標志蛋白的表達升高。小RNA(microRNA,miR)是一類長度約22~28個核苷酸的非編碼小分子RNA,其在轉錄后
2、水平和翻譯水平的基因調控過程中發(fā)揮重要作用,參與了許多生理病理過程的調節(jié)。我們的前期工作表明miR-21在肝星狀細胞激活過程中起著重要的作用。本研究的目的是探討miR-21在人肝細胞株(QSG-7701) EMT中的作用和機理。
方法:
1.TGF-β1對人肝細胞EMT的作用。
用10ng/mlTGF-β1刺激人肝細胞株QSG-7701細胞1、3、5、7天后,顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化,western bl
3、ot檢測上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)和間皮標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)的表達。
2.TGF-β1刺激miR-21的表達。
用10ng/mlTGF-β1刺激人肝細胞株QSG-7701細胞1、3、5、7天后,real-timeRT-PCR檢測miR-21的表達。
3.MiR-21介導了TGF-β1對人肝細胞EMT作用。
轉染100nM miR-21抑制劑(miR-21 inhibitor)沉默m
4、iR-21后,TGF-β1刺激人肝細胞株QSG-77015天,轉染24小時后real-time RT-PCR檢測miR-21的表達。TGF-β1刺激5天后顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化。western blot檢測上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)和間皮標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)。
4.MiR-21對人肝細胞EMT的作用。
用100nMmiR-21模擬物(miR-21mimics)轉染人肝細胞株,24小時后用real-t
5、imeRT-PCR檢測miR-21的表達。3天后用顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化,用western blot檢測上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)和間皮標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)。
5.PTEN/Akt通路介導了人肝細胞EMT
(1) TGF-β1刺激細胞后,western blot檢測PTEN。
(2)轉染miR-21模擬物和miR-21抑制劑后,western blot檢測PTEN。
(3)用5μ
6、M的Akt抑制劑(Akt inhibitorⅣ)預處理后,TGF-β1刺激細胞。用western blot檢測Akt磷酸化,上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)、間皮標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)的表達。
(4)100nMmiR-21模擬物轉染人肝細胞株QSG-7701細胞后,加入5μM的Akt抑制劑(Akt inhibitorⅣ),western blot檢測Akt磷酸化,上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)、間皮標志蛋白(N-鈣粘蛋白
7、、波形蛋白)的表達。
結果:
1.TGF-β1刺激引起了人肝細胞的EMT
(1) TGF-β1刺激引起了肝細胞形態(tài)改變,由原先多邊形的緊密排列的上皮樣細胞,變?yōu)榧氶L紡錘樣有較多觸角的成纖維細胞狀樣細胞。
(2) TGF-β1刺激引起了上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)表達下降。
(3) TGF-β1刺激引起了間質標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達上升。
2.TGF-β1刺激人肝細
8、胞miR-21的表達:在TGF-β1刺激5天后miR-21的表達明顯上升。
3.MiR-21介導了TGF-β1的EMT作用。
(1)轉染miR-21抑制劑24小時后,miR-21的表達明顯下降。
(2)形態(tài)改變:miR-21抑制劑組較對照組性狀更圓鈍,觸角更少,排列更緊密。
(3)上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)較對照組表達升高。
(4)間質標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達較對照組表達
9、下降。
以上結果提示下調miR-21表達后,阻斷了TGF-β1致肝細胞EMT作用。4.miR-21轉染直接刺激人肝細胞的EMT
(1)轉染miR-21模擬物24小時后,miR-21的表達明顯增高。
(2) miR-21模擬物轉染組細胞形態(tài)較對照組變瘦長,觸角更多,排列更松散。
(3) miR-21模擬物轉染組上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)較對照組表達下降。
(4) miR-21模擬物轉染組
10、間質標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達較對照組下降。
以上結果提示miR-21過表達可直接刺激人肝細胞的EMT
5.PTEN/Akt通路介導了人肝細胞的EMT作用
(1) TGF-β1調節(jié)了PTEN蛋白的表達:TGF-β1刺激細胞后PTEN表達下降。
(2) miR-21調節(jié)了PTEN蛋白的表達:轉染miR-21模擬物后PTEN表達下降,轉染miR-21抑制劑后PTEN表達上升。
(
11、3)抑制Akt減少了TGF-β1的EMT作用:Akt抑制劑+TGF-β1組較TGF-β1組上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)表達升高。間質標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達下降。
(4)抑制Akt減少了miR-21的EMT作用:Akt抑制劑+miR-21模擬物組較miR-21模擬物組上皮標志蛋白(E-鈣粘蛋白)表達升高,間質標志蛋白(N-鈣粘蛋白、波形蛋白)表達下降。
結論:
MiR-21通過PTEN/Akt
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