妊娠早期高雌激素暴露影響子代脂代謝表觀遺傳機(jī)制研究.pdf

1、本文對(duì)妊娠早期高雌激素暴露影響子代脂代謝表觀遺傳機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為四個(gè)部分：
　　第一部分：妊娠早期高雌激素暴露子代的生長(zhǎng)發(fā)育和脂代謝追蹤研究。
　　目的：研究妊娠早期高雌激素環(huán)境暴露的子代的生長(zhǎng)發(fā)育和脂代謝狀況，比較分析母體妊娠期的雌激素水平與子代血脂水平的相關(guān)性。
　　方法：本研究對(duì)2002年1月至2010年7月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院出生的401例單胎子代兒童期進(jìn)行隨訪，年齡為3-10歲，其中自然妊

2、娠組142例（對(duì)照組），新鮮胚胎移植組153例（高雌暴露組，簡(jiǎn)稱(chēng)IVF-ET組），冷凍胚胎移植組(FET組)106例。隨訪的指標(biāo)包括子代的基本情況，其母親妊娠時(shí)期的情況，以及子代的血壓、心率、空腹血脂、血常規(guī)等指標(biāo)。IVF-ET組的母體雌激素測(cè)定日期是移植日及妊娠8周時(shí)，同期自然妊娠的母親雌激素測(cè)定是在排卵后3-5天及妊娠8周。通過(guò)病案系統(tǒng)回顧性查閱隨訪子代的母親移植日的雌激素水平，對(duì)二者進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：排除出生體重、

3、出生身長(zhǎng)、孕周、性別、月齡、體重指數(shù)以及母親妊娠年齡等干擾因素后，自然妊娠組、新鮮胚胎移植組、冷凍胚胎移植組子代的血常規(guī)指標(biāo)、血壓、心率無(wú)顯著性差異，而子代血脂水平出現(xiàn)改變。新鮮胚胎移植組子代的總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平顯著高于其他兩組，而冷凍胚胎移植組和對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，高密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯在三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。新鮮胚胎移植組母親妊娠期經(jīng)過(guò)促排卵處理，其移植當(dāng)日和妊娠第8周的雌激素水平都顯著高于同期自然妊娠組，其子代

4、的高膽固醇血癥的發(fā)生率(10.53％)顯著高于對(duì)照組(3.29％)，子代的總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平和母親移植日的雌激素水平呈顯著正相關(guān)，而子代高密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯水平和母親移植日的雌激素水平未呈現(xiàn)相關(guān)性。
　　結(jié)論：促排卵治療的孕婦在妊娠早期處于一種超生理范圍的高雌激素狀態(tài)，是研究宮內(nèi)高雌激素暴露的理想模型。母親妊娠期間的高雌激素狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致子代兒童期的高血脂傾向，而冷凍技術(shù)對(duì)子代血脂水平無(wú)影響。宮內(nèi)高雌激素暴露的子

5、代兒童期的總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平與其母親移植日的雌激素水平有明顯的正相關(guān)性，其高膽固醇血癥發(fā)生率顯著增高。
　　第二部分：雌激素調(diào)控肝細(xì)胞脂代謝的機(jī)制研究。
　　目的：探討雌激素對(duì)肝細(xì)胞合成總膽固醇和低密度脂蛋白的影響及其相關(guān)機(jī)制，明確雌激素在肝細(xì)胞脂代謝調(diào)控中的作用。
　　方法：體外實(shí)驗(yàn)以人肝癌細(xì)胞系HepG2為研究對(duì)象，通過(guò)不同濃度的雌激素和（或）同時(shí)加入雌激素受體阻斷劑處理細(xì)胞，采用ELISA方法檢測(cè)細(xì)

6、胞上清的膽固醇含量，熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中HMGCR，CYP7A1，LCAT, LPL的表達(dá);利用染色質(zhì)免疫共沉淀和熒光素酶活性測(cè)定檢測(cè)HMGCR啟動(dòng)子區(qū)域的雌激素反應(yīng)元件與雌激素受體的結(jié)合;高濃度雌激素處理原代小鼠胎肝細(xì)胞，熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中HMGCR的表達(dá)。
　　結(jié)果：雌激素能夠明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞總膽固醇和低密度脂蛋白的生成和上調(diào)HMGCR的表達(dá)，并且這種上調(diào)作用可被雌激素受體阻斷劑完全阻斷，但雌激素對(duì)CY

7、P7A1，LCAT, LPL的表達(dá)無(wú)影響。HMGCR轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-3081/-3069bp處存在雌激素反應(yīng)元件結(jié)構(gòu)，在HepG2細(xì)胞中，雌激素可通過(guò)該雌激素反應(yīng)元件調(diào)節(jié)HMGCR的表達(dá)。在原代胎鼠肝細(xì)胞中，高濃度雌激素能夠顯著上調(diào)的HMGCR的表達(dá)。
　　結(jié)論：高濃度雌激素可上調(diào)人肝細(xì)胞系和原代胎肝細(xì)胞的HMGCR的表達(dá)。雌激素通過(guò)作用于HMGCR轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-3081/-3069bp處的雌激素反應(yīng)元件使HMGCR的表達(dá)升高，從而

8、增加肝細(xì)胞膽固醇的生成，發(fā)揮調(diào)控脂代謝的作用。
　　第三部分：孕期高雌激素動(dòng)物模型的建立及子代肝臟膽固醇合成限速酶HMGCR甲基化改變。
　　目的：研究宮內(nèi)高雌壞境出生小鼠子代的生長(zhǎng)發(fā)育和脂代謝狀況，以及膽固醇合成通路上的限速酶HMGCR的差異甲基化區(qū)的甲基化改變，評(píng)估宮內(nèi)高雌激素暴露子代小鼠發(fā)生高血脂的風(fēng)險(xiǎn)及其機(jī)制。
　　方法：通過(guò)促排卵技術(shù)建立孕期高雌激素小鼠模型，自然妊娠小鼠為對(duì)照組，監(jiān)測(cè)孕鼠妊娠階段的血清雌激素

9、水平，檢測(cè)對(duì)照組(Control)和宮內(nèi)高雌激素組（Intrauterine high estrogen group，簡(jiǎn)寫(xiě)為HE）子代3周齡和8周齡的體重、肝臟比重;ELISA檢測(cè)出生子代3周齡和8周齡的血清血脂水平。對(duì)12.5天的胎鼠、3周和8周的出生子代小鼠肝臟行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HMGCR的表達(dá);采用亞硫酸氫鹽測(cè)序的方法檢測(cè)12.5天的胎鼠和3周齡子代小鼠肝臟HMGCR DMR的甲基化改變。
　　結(jié)果：通過(guò)促排卵技術(shù)可以建立

10、孕期高雌激素小鼠模型。宮內(nèi)高雌暴露的子代小鼠的體重在3周齡和8周齡無(wú)差異，而肝臟比重在3周齡明顯高于對(duì)照組，8周齡無(wú)差異。子代小鼠幼兒期的血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯水平明顯高于對(duì)照組，而高密度脂蛋白膽固醇水平二者無(wú)差異;到了成年期，子代小鼠的血脂水平與對(duì)照組差異縮小，但是低密度脂蛋白膽固醇仍顯著高于自然妊娠組子代。宮內(nèi)高雌暴露的子代小鼠在胎兒時(shí)期、3周齡時(shí)期的HMGCR的表達(dá)顯著性升高，而其肝臟在這兩個(gè)時(shí)期的HMGCR

11、DMR的總體甲基化水平明顯低于對(duì)照組。
　　結(jié)論：宮內(nèi)高雌環(huán)境出生子代小鼠幼兒期和成人期出現(xiàn)血脂顯著性增高的異常表型。其子代小鼠在胎兒期、幼兒期的HMGCR表達(dá)顯著升高，而子代小鼠肝臟在胎兒時(shí)期和幼兒期的HMGCR差異甲基化區(qū)總體甲基化水平顯著降低，是HMGCR表達(dá)升高的主要機(jī)制，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體膽固醇合成異常。
　　第四部分：宮內(nèi)高雌激素暴露胎鼠肝臟長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)譜分析及Gm5196調(diào)控膽固醇生成的機(jī)制研究。
　　

12、目的：系統(tǒng)的了解生命早期高雌激素暴露對(duì)子代長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)表達(dá)譜的影響，篩選與子代高血脂表型相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，驗(yàn)證其生物學(xué)功能并探討相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：研究入選了宮內(nèi)高雌激素組和正常妊娠組的妊娠12.5天的ICR胎鼠肝臟各五例，進(jìn)行LncRNAs表達(dá)芯片分析。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法在25例胎鼠肝臟組織中驗(yàn)證差異明顯的8個(gè)lncRNA。利用生物信息學(xué)對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行分析，篩選目標(biāo)lncRNA Gm5196，

13、并在HepG2上采用實(shí)時(shí)定量PCR方法驗(yàn)證雌激素處理后其表達(dá)的變化。應(yīng)用siRNA特異性降低Gm5196的表達(dá)后，觀察與其相關(guān)mRNA Osbpl5及HepG2細(xì)胞總固醇生成的變化。
　　結(jié)果：通過(guò)胎鼠肝臟長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)譜分析，我們發(fā)現(xiàn)在宮內(nèi)高雌暴露的胎兒肝臟組織中差異表達(dá)的lncRNAs的數(shù)目為633個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的lncRNAs數(shù)目為316個(gè)，下調(diào)表達(dá)的lncRNAs數(shù)目為317個(gè)。我們?cè)谔ジ沃序?yàn)證了8個(gè)差異顯著的ln

14、cRNA，與芯片的結(jié)果一致，證實(shí)了芯片結(jié)果的可靠性。CNC網(wǎng)絡(luò)圖提示差異lncRNA Gm5196可能影響脂代謝。HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示雌激素可以下調(diào)Gm5196并上調(diào)Osbpl5的表達(dá)，干擾Gm5196可以上調(diào)Osbpl5的表達(dá)并促進(jìn)總膽固醇的生成。
　　結(jié)論：宮內(nèi)高雌激素暴露的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致胎鼠肝臟lncRNAs表達(dá)譜的改變。雌激素能夠降調(diào)lncRNA Gm5196的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Gm5196相關(guān)mRNA Osbpl5的表達(dá)。干擾