阿維拉霉素生產(chǎn)菌推理選育及其發(fā)酵條件的初步研究.pdf

1、阿維拉霉素是一種混合型的低聚糖，作為飼料添加劑應(yīng)用的抗生素。它通過(guò)維持動(dòng)物腸道內(nèi)細(xì)菌的正常平衡，減少動(dòng)物正常營(yíng)養(yǎng)的消耗，從而達(dá)到促生長(zhǎng)目的。本論文對(duì)一株綠色產(chǎn)色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素進(jìn)行了初步研究，主要包括菌種鑒定，高產(chǎn)菌株的多重誘變及推理選育，阿維拉霉素發(fā)酵培養(yǎng)基及條件優(yōu)化，以及擴(kuò)大培養(yǎng)等內(nèi)容。 采用細(xì)菌形態(tài)學(xué)、電鏡透射與掃描圖象分析，菌株A-05的菌絲較為粗壯，不產(chǎn)生橫隔膜，孢子短，卵圓形，表面為長(zhǎng)刺所覆蓋，孢子絲單分枝，

2、有許多松敞或緊密的左旋螺旋；菌株細(xì)胞壁組分含有L，L一二氨基庚二酸，無(wú)特征性糖(胞壁I型，糖型C)，屬于鏈霉菌屬；生理生化特征與與綠色產(chǎn)色鏈霉菌相似；16S rDNA分析表明此菌株與綠色產(chǎn)色鏈霉菌同源性100％，因此初步判定菌株A-05為鏈霉菌屬，綠色產(chǎn)色鏈霉種。該菌株與綠色產(chǎn)色鏈霉菌在利用棉子糖和纖維素方面存在差異，因此判定該菌株為一株綠色產(chǎn)色鏈霉菌的變種，并暫命名．Streptomyces virichromodenes Var．L

3、H。 通過(guò)對(duì)菌種A-05的代謝產(chǎn)物阿維拉霉素進(jìn)行定性和定量分析，建立了阿維拉霉素萃取的工藝條件、檢測(cè)發(fā)酵液中阿維拉霉素含量的微生物效價(jià)測(cè)定法和高效液相色譜法。采用二劑量法回歸得到效價(jià)計(jì)算公式：Log<'γ>=0.6592R<'2>+0.5717。高效液相色譜法和質(zhì)譜法分析驗(yàn)證了發(fā)酵產(chǎn)物為阿維拉霉素，其中以阿維拉霉素A為主要成分，分子量為1401，保留時(shí)間為35.46min。菌株經(jīng)3000Gy的Co<'60>射線誘變、80U/mL

4、阿維拉霉素抗性平板中抗性突變株的篩選、100U/mL鏈霉素抗性平板中抗性突變株的篩選、0.15％2-脫氧-D-葡萄糖抗性平板中抗性突變株篩選、0.35％α-氨基丁酸抗性平板中抗性突變株的篩選，得到一株阿維拉霉素高產(chǎn)菌株H-15，產(chǎn)量從原來(lái)的9.8U/mL提高到68.7U/mL，提高了近580％。 通過(guò)對(duì)碳源、氮源的單因素考察確定了較優(yōu)碳源為可溶性淀粉，木糖次之，而乳糖產(chǎn)量相對(duì)較低；較優(yōu)氮源為豆粕粉，大豆蛋白胨次之，無(wú)機(jī)氮硝酸鉀則

5、較低。并利用響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成進(jìn)行了優(yōu)化，得到較適培養(yǎng)基為可溶性淀粉20.12g/L，D-木糖為7.81g/L，豆粕粉為25.23g/L，大豆蛋白胨為5.06g/L，MnCl<,2> 0.60g/L，MgSO<,4>.7H<,2>O 0.60g/L，pH7.2～7.4。培養(yǎng)基優(yōu)化后阿維拉霉素效價(jià)比文獻(xiàn)報(bào)道的初始培養(yǎng)基提高了65％。 對(duì)搖瓶條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化試驗(yàn)。斜面菌種保藏時(shí)間對(duì)種子活力影響不大，低溫保藏具有較好的穩(wěn)定

6、性，保藏一周的斜面生物效價(jià)達(dá)到最高，斜面相對(duì)效價(jià)為104％，當(dāng)保藏三周后，斜面生物效價(jià)只有72％；一級(jí)搖瓶種齡24h，接種量5％，裝液量100mL/500mL三角瓶，pH7.2～7.4，發(fā)酵時(shí)間48h，阿維拉霉素有較高效價(jià)；發(fā)酵過(guò)程中在38h和146h兩次補(bǔ)加1％葡萄糖時(shí)，產(chǎn)量比不補(bǔ)料提高了16％左右；乙酸鈉在16h補(bǔ)加0.1％時(shí)，產(chǎn)量比不補(bǔ)料提高了29％；20h補(bǔ)加0.5％的豆油，產(chǎn)量比不補(bǔ)料提高125％。在5L玻璃罐試驗(yàn)結(jié)果表明，菌