紅樹林生境中高溫耐堿酯酶的篩選及基因克隆.pdf

1、酯酶是一種催化酯鍵水解和合成的酶的總稱，它廣泛存在于動植物和微生物中。由于自然界中微生物資源相對豐富，同時利用微生物發(fā)酵產酶具有便于工業(yè)化生產等優(yōu)點，微生物酯酶得到關注，并且已經廣泛應用于農業(yè)、食品業(yè)、醫(yī)藥化學、污水處理和生物修復等領域，而酯酶的酶促反應具有較高的底物專一性、區(qū)域選擇性或者對映選擇性，它是合成手性化合物(如手性藥物，農藥等)的高效生物催化劑，微生物酯酶已成為研究熱點。而紅樹林這一特殊環(huán)境蘊藏了豐富微生物資源，可以分離到產

2、生多種具有特殊生物活性物質的微生物。
　　本文從深圳福田紅樹林自然保護區(qū)土壤樣品中分離純化獲得一株高酯酶活性的菌株，通過形態(tài)學和分子生物學初步鑒定該菌株為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，命名為Bacillus sp.W77。該菌株是耐鹽菌，其最適生長溫度為37℃，最適pH為9.0，且在堿性范圍內適應性較好。
　　對所產的粗酶液進行酶活測定，發(fā)現該菌產的酯酶的最適反應溫度是50℃，最適pH為8.0，且在堿性條件下較穩(wěn)定

3、；采用響應面法(RSM)對土壤菌株Bacillus sp.W77的產酯酶條件進行了優(yōu)化，確定最優(yōu)條件為：培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1.0 g，酵母粉6.67 g，K2HPO40.56 g，MgSO4·7H2O0.36 g，NaCl0.05 g，(NH4)2SO40.1 g，pH7.0，2％接種量接種到起始30 mL培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37℃在轉速180 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h，在最佳產酶條件下，優(yōu)化后酯酶活力的OD405值

4、由0.829提高到1.235，實際值達到理論預測值的97.5%。
　　為了獲得菌株的酯酶基因，本論文構建了該菌株的基因組文庫，通過酯酶的選擇培養(yǎng)基初步篩選具有酯酶活性的轉化子，其中一個含有1494 bp的HindⅢ酶切片段轉化子具有較強酯酶活性，經測序比對，該片段內含一個由1470 bp的開放閱讀框架，編碼489個氨基酸，G+C含量49.5%，等電點預測為4.96，預測編碼產物分子量約為54 kDa。同源性分析表明，該ORF與Ba