IL-24和EGF受體干擾序列融合基因的克隆、表達及活性研究.pdf

1、IL-24(白細胞介素24)具有抑制腫瘤血管生成活性、刺激免疫系統(tǒng)應答和誘導腫瘤細胞凋亡的方式聯(lián)合發(fā)揮抗腫瘤效應。大多數(shù)腫瘤細胞尤其是實體瘤細胞表面有大量EGFR(Epithelial Growth Factor Receptor，表皮生長因子受體)的表達。表皮生長因子肽段中的C環(huán)是EGFR特異性結合位點，稱為EGF受體干擾序列(EGFRi，Epithelial Growth Factor Receptor interference)。

2、EGFRi能與表皮生長因子特異性結合，但不具有刺激腫瘤細胞生長的作用，特異的腫瘤靶向性和IL-24獨特免疫學作用的有機結合為腫瘤的細胞因子治療提供了新的思路。本論文應用重疊延伸PCR(Overlapping PCR)技術將IL-24與EGFRi連接，并研究了該融合基因在大腸桿菌中的表達和對重組菌的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，同時對純化的融合蛋白進行抑瘤活性研究。主要研究內容和結果如下：
　　 1.IL-24的克隆及在大腸桿菌中表達

3、>　　 以含有切除了N端信號肽的IL-24成熟肽基因的質粒PMAL-c2x-IL-24為模板，通過PCR技術獲得IL-24，構建表達載體PET-22b-IL-24，將其電轉化到E.coliBL21(DE3)中，IPTG誘導后表達產(chǎn)物的相對分子質量與預期值(19 kD)一致。利用Ni2+親合層析柱純化誘導表達的的IL-24蛋白，MTT檢測結果證實其具有體外抑瘤活性，利用Ni2+親合層析柱純化誘導表達的的IL-24蛋白，MTT檢測結果證實

4、其具有體外抑瘤活性。
　　 2.融合基因EGFRi-IL-24的克隆及在大腸桿菌中表達
　　 以含有切除了N端信號肽的IL-24成熟肽基因的質粒PET-22b-IL-24為模板，通過重疊延伸PCR(Overlapping PCR)技術獲得了融合基因EGFRi-IL-24，構建克隆載體pUC-EGFRi-IL-24；構建表達載體PET-22b-EGFRi-IL-24，將其電轉化到E.coliBL21(DE3)中，IPTG誘

5、導后表達產(chǎn)物的相對分子質量與預期值(22 kD)一致。
　　 3.融合蛋白的Ni2+親合層析柱純化
　　 利用Ni2+親合層析柱純化重組菌表達的融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測，表達的融合蛋白純化后純度有了大幅度的提高，融合蛋白的純度超過了80％。
　　 4.融合蛋白體外抑瘤活性的研究
　　 以MTT法初步評價融合蛋白對乳腺癌細胞MCF-7和肺癌細胞A549的抗腫瘤活性，經(jīng)相同濃度梯度的融合蛋白EGFRi