pAdtrack-cmv-rHSG重組穿梭質(zhì)粒載體的構(gòu)建、序列分析及rHSG生物信息分析.pdf

1、目的：(1)在前期構(gòu)建pExpress-1-Rhsg重組質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上，構(gòu)建大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene,Rhsg)pAdtrack-cmv-Rhsg重組穿梭質(zhì)粒并鑒定，為進(jìn)一步構(gòu)建腺病毒載體及腦血管痙攣的基因治療提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 (2)對測序報告結(jié)果中Rhsg基因序列進(jìn)行序列與結(jié)構(gòu)相關(guān)的生物信息分析,為認(rèn)識該基因結(jié)構(gòu)與功能提供借鑒。
　　 方法：
　　 (

2、1)目的基因的提取：復(fù)蘇本室保存的含pExpress-1-Rhsg質(zhì)粒的Jm109菌，用質(zhì)粒抽取試劑盒抽取質(zhì)粒pExpress-1-Rhsg，并在PCR儀中擴(kuò)增出目的基因Rhsg Cdna。
　　 (2)穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定：①復(fù)蘇本室保存的含腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-cmv的DH5α菌種，用質(zhì)粒抽取試劑盒抽取質(zhì)粒pAdtrack-cmv；②將PCR后Rhsg Cdna連接到Pgm-T質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒Pgm-T-Rhs

3、g，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定；③將Pgm-T-Rhsg重組質(zhì)粒在LB固體瓊脂培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，提取Pgm-T-Rhsg質(zhì)粒；④用BglⅡ、Eco RV對Pgm-T-Rhsg重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，提取目的基因并鑒定；⑤用BglⅡ和Eco RV雙酶切pAdtrack-cmv質(zhì)粒得到線性化的pAdTrack-CMV 片斷，在T4DNA連接酶下與目的基因連接，構(gòu)建出重組pAdtrack-cmv-Rhsg穿梭質(zhì)粒，并對重組

4、穿梭質(zhì)粒pAdtrack-cmv-Rhsg進(jìn)行酶切鑒定；⑥將重組穿梭質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行DNA序列分析。
　　 (3)Rhsg基因生物信息分析：根據(jù)測序報告結(jié)果中Rhsg基因序列，用生物信息學(xué)方法對其進(jìn)行同源性、分子量、蛋白跨膜區(qū)、等電點、親疏水性、蛋白二級結(jié)構(gòu)等項的分析和預(yù)測。
　　 結(jié)果：
　　 (1)從質(zhì)粒pExpress-1-Rhsg中成功提取出了Rhsg Cdna基因。
　　 (2)重組pAdtr

5、ack-cmv-Rhsg穿梭質(zhì)粒經(jīng)BglⅡ和Eco RV雙酶切后，進(jìn)一步將重組體進(jìn)行基因測序分析，驗證了克隆的Rhsg Cdna序列與GenBank[AF036536]公布的Rhsg序列吻合。這一結(jié)果表明重組體pAdtrack-cmv-Rhsg中插入的目的基因是正向、單倍插入。
　　 (3)Rhsg生物信息分析結(jié)果顯示，Rhsg全長4151bp，編碼一757氨基酸殘基的蛋白，可能為一跨膜蛋白，經(jīng)基因Genebank查詢發(fā)現(xiàn)與人H