膜膽固醇對重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素活性影響的研究.pdf

1、目的:
　　 1、研究重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(recombinant Vibrio vulnificus hemolysin,rVvhA)對HUVEC和J774A.1細胞的細胞毒性作用。
　　 2、研究膜膽固醇對重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素活性的影響。
　　 3、為探索天然創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(Vibrio vulnificus cytolysin,VVC)的細胞毒性分子機制提供一些實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　

2、 1、誘導含pET-28a(+)vvhA重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌表達創(chuàng)傷弧菌溶細胞素融合蛋白rVvhA,應用三步洗滌結(jié)合Ni2+親和層析方法對rVvhA進行純化,利用稀釋復性加分步透析相結(jié)合的方法進行蛋白質(zhì)復性。
　　 2、復性后rVvhA作用于HUVEC和J774A.1細胞,MTT測定細胞存活率。在rVvhA作用前,HUVEC和J774A.1細胞先經(jīng)MβCD預處理降低膜上膽固醇含量,待rVvhA作用HUVEC和J774A.

3、1細胞8h后,MTT測定細胞的存活率；Fluo-3 AM鈣離子熒光探針結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡測定rVvhA作用細胞瞬間胞內(nèi)鈣離子濃度變化情況；測定細胞培養(yǎng)上清中的鉀離子和乳酸脫氫酶濃度；流式細胞儀測定細胞凋亡和壞死率。
　　 結(jié)果:
　　 1、含pET-28a(+)vvhA重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導后表達的融合蛋白Mr約為54 kDa,電泳結(jié)果與該融合蛋白的理論推算值基本相符。表達的

4、蛋白質(zhì)經(jīng)三步洗滌與Ni2+-NTA柱純化后,其純度達90.0％左右。純化的rVvhA稀釋復性后證明具有溶血活性。
　　 2、rVvhA作用HUVEC和J774A.1細胞可抑制細胞增殖,降低細胞的存活率,且呈劑量依賴性。rVvhA作用后細胞內(nèi)鈣離子濃度增加,培養(yǎng)上清中鉀離子濃度和乳酸脫氫酶活性也增加。流式測定結(jié)果可見1.0 HU/ml和2.0 HU/ml rVvhm可分別誘導J774A.1和HUVEC細胞發(fā)生明顯凋亡,凋亡率分別為

5、(13.5±2.14)％和(14.8±2.3)％。2.0 HU/ml和3.0 HU/ml rVvhA可分別誘導J774A.1和HUVEC細胞發(fā)生明顯壞死。MβCD預處理可以減少細胞膜上膽固醇含量,且5mM MβCD作用HUVEC和J774A.1細胞30min沒有細胞毒性。比較MβCD預處理組與rVvhA直接作用組,可見前者細胞存活率明顯增加,rVvhA引起的鈣離子內(nèi)流、鉀離子和乳酸脫氫酶釋放均受到不同程度的抑制,rVvhA誘導的細胞凋亡