基于化學(xué)生物學(xué)的中藥有效成分牛蒡子苷元等的作用靶點(diǎn)及體內(nèi)分布研究.pdf

1、化學(xué)生物學(xué)是一門用新穎的化學(xué)方法來闡釋和操縱生物系統(tǒng)，研究生物學(xué)現(xiàn)象，解決現(xiàn)實(shí)世界中的生物學(xué)問題的學(xué)科。近十年來，化學(xué)生物學(xué)得到長(zhǎng)足的發(fā)展，其影響已經(jīng)拓寬到了更廣泛的學(xué)科領(lǐng)域。中藥的化學(xué)生物學(xué)將傳統(tǒng)的基于結(jié)構(gòu)的中藥化學(xué)成分研究，引入到“生物學(xué)活性”研究的新層面，在分子靶標(biāo)和作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，闡釋有效成分的核心結(jié)構(gòu)與其靶標(biāo)蛋白的作用關(guān)系。然而中藥藥效成分的體內(nèi)吸收、代謝和分布等具有復(fù)雜性，通常其在體內(nèi)又具有“多重靶點(diǎn)”的特性，這就給中藥的

2、化學(xué)生物學(xué)研究帶來了很大的挑戰(zhàn)。為了建立中藥藥效成分的化學(xué)生物學(xué)研究平臺(tái)，本論文分別選擇了牛蒡苷元和甘草次酸作為實(shí)例，展開了作用靶點(diǎn)確證和代謝分布的化學(xué)生物學(xué)研究。
　　本論文首先采用懸浮聚合技術(shù)制備了聚乙烯醇磁性微球，開展了基于點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)捕獲靶標(biāo)蛋白的磁性捕獲技術(shù)的研究。一方面以牛血清白蛋白(BSA)為模型蛋白，采用熒光素以及疊氮對(duì)其進(jìn)行了雙標(biāo)記;另一方面通過逐步反應(yīng)將磁球的端位引入了炔基基團(tuán)，中間修飾了二硫鍵結(jié)構(gòu);使得該磁球

3、可以基于點(diǎn)擊化學(xué)的方法特異性的捕獲疊氮修飾的BSA，又可以通過還原二硫鍵而將捕獲蛋白解離下來。以此為模型通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法來檢測(cè)磁球捕獲的蛋白的能力，并通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)微球的粒徑和官能團(tuán)覆蓋度等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，最佳性能磁球的粒徑范圍為1.25-6.31μm，官能團(tuán)覆蓋度范圍為48.53-73.05％，其捕獲蛋白能力最強(qiáng)，約每毫升磁球捕獲67.07μg的BSA，與實(shí)際捕獲量（63.92±0.18μg）非常接近，證實(shí)了模型

4、的可靠性并可以進(jìn)行特異性靶標(biāo)蛋白的富集。
　　其次，本論文利用疊氮標(biāo)記的非天然糖1，3，4，6-O-乙酰-N-疊氮乙酰胺(Ac4ManNAz)孵育人肺腺癌A549細(xì)胞，通過代謝標(biāo)記手段產(chǎn)生了疊氮標(biāo)記的糖蛋白，再使用上述炔基修飾的磁球?qū)ζ溥M(jìn)行捕獲分離。發(fā)現(xiàn)1 mL磁球可以分離得到51μg細(xì)胞表面糖蛋白，驗(yàn)證了基于點(diǎn)擊化學(xué)方法捕獲糖蛋白的可行性。在此基礎(chǔ)上本論文制備了疊氮修飾的聚乙烯醇磁球和炔基化修飾的牛蒡苷元，通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，針對(duì)

5、人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)開展了捕獲牛蒡苷元靶蛋白的研究。PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)的靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，牛蒡苷元抗炎靶點(diǎn)可能為3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDPK1)。經(jīng)SDS-PAGE電泳和western blot分析，利用抗PDPK1抗體驗(yàn)證了PDPK1蛋白大量存在于所磁性捕獲的蛋白中。進(jìn)一步結(jié)合分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)分析，證實(shí)牛蒡子苷元與已知的PDPK1抑制劑253具有相近的作用方式及作用強(qiáng)度，初步確認(rèn)PDPK1為牛蒡子

6、苷元的作用靶點(diǎn)之一，為深入研究牛蒡子苷元的作用機(jī)理打下基礎(chǔ)。
　　為了改善磁球捕獲靶蛋白技術(shù)在組織細(xì)胞定位觀測(cè)以及在蛋白捕獲量上的局限性，本論文迸一步又設(shè)計(jì)了一種新穎的聚賴氨酸自組裝熒光納米球，經(jīng)透射電鏡形態(tài)觀察該微球大小均勻，粒度分析結(jié)果表明平均粒徑為38nm。經(jīng)酶標(biāo)儀熒光檢測(cè)，552 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，其最大發(fā)射波長(zhǎng)為596 nm，熒光強(qiáng)度可以達(dá)到相同濃度Rhodamine溶液的兩倍，提高了捕獲載體的生物相容性、熒光可示蹤性以及

7、捕獲分離的便捷性。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行了疊氮功能化修飾，并通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與炔基牛蒡子苷元結(jié)合，制備了連接有牛蒡子苷元的熒光納米球。將上述微球通過尾靜脈注射用于急性肺炎小鼠，進(jìn)行活體成像分析，發(fā)現(xiàn)其胸腔的濃度明顯升高;離體各器官的熒光強(qiáng)度測(cè)定也顯示，模型組小鼠肺部的熒光強(qiáng)度可以達(dá)到其它器官的2倍以上，證實(shí)了牛蒡子苷元的靶點(diǎn)主要集中在肺部。利用人支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞開展牛蒡子苷元的細(xì)胞成像研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)合有牛蒡子苷元的熒光納米球在細(xì)胞內(nèi)有

8、結(jié)合特異性，證明牛蒡子苷元的靶點(diǎn)主要分布在胞漿中。
　　利用上述合成的連接有牛蒡子苷元的聚賴氨酸熒光納米自組裝納米球以及空白納米球，分別對(duì)BEAS-2B細(xì)胞中的靶蛋白進(jìn)行了捕獲研究。經(jīng)過流式細(xì)胞分析，確定了共同孵育3h為最佳的捕獲時(shí)間;通過裂解細(xì)胞和超濾對(duì)捕獲蛋白進(jìn)行富集，并經(jīng)DTT還原和超濾濃縮得到了相應(yīng)的結(jié)合蛋白。SDS-PAGE電泳分析顯示，陽(yáng)性蛋白富集率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于和陰性蛋白。經(jīng)HPLC-MS/MS鑒定，陽(yáng)性組共鑒定出675種

9、蛋白，陰性組為750種蛋白;使用Protein Score和Coverage軟件進(jìn)行條件過濾，發(fā)現(xiàn)其中陽(yáng)性樣品中有19種蛋白，陰性樣品中有14種蛋白為可能的目標(biāo)蛋白;進(jìn)一步采用生物信息學(xué)工具String9.0和KEGG對(duì)目標(biāo)蛋白的相互作用關(guān)系進(jìn)行分析，最終將陽(yáng)性蛋白樣品劃分為4個(gè)功能組，分別與能量代謝、炎癥、鈣調(diào)節(jié)和熱休克等功能相關(guān);而陰性樣品只能劃分出1個(gè)細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白組，證明為非特異性吸附的蛋白。進(jìn)一步通過AutoDock4.0軟

10、件將上述陽(yáng)性蛋白與牛蒡子苷元進(jìn)行分子對(duì)接，確認(rèn)其可能的蛋白靶點(diǎn)。篩選結(jié)果表明，牛蒡子苷元對(duì)肽基脯氨酰異構(gòu)酶(PPIA)，熱休克蛋白70(HSPA8)，肌動(dòng)蛋白γ1(ACTG1)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)等顯示出較強(qiáng)的結(jié)合力，結(jié)合能分別為-7.89，-7.62，-7.27和-7.22 kcal/mol，并存在合理的氫鍵結(jié)合，證實(shí)了牛蒡子苷元的作用靶點(diǎn)為PPIA，HSPA8，ACTG1和GAPDH，分別與胞內(nèi)鈣離子、熱休克抑制、炎

11、癥通路和調(diào)控能量代謝相關(guān)。
　　最后，本論文圍繞桔?！耙?jīng)報(bào)使”改變甘草的藥效分子甘草次酸的動(dòng)態(tài)分布過程開展化學(xué)生物學(xué)研究。分別對(duì)甘草次酸進(jìn)行衍生化，制備可用于甲苯磺酰氯親核取代進(jìn)行放射性18F標(biāo)記的前體衍生物，并對(duì)其18F標(biāo)記條件進(jìn)行探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過羧基衍生的直鏈羥基取代后再進(jìn)行親核取代，利于18F-甘草次酸的合成，產(chǎn)率為16.9％，放射性強(qiáng)度為150mCi，放射化學(xué)純度為98.6％。以此為基礎(chǔ)建立了基于PET的甘草次酸藥代

12、分布研究模型，以口服桔梗總皂苷進(jìn)行干預(yù)，再通過小鼠尾靜脈注射18F-甘草次酸，分別對(duì)主要器官的血藥濃度進(jìn)行了在線活體的觀測(cè)。經(jīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在注射前一次性灌胃給桔梗總皂苷(50g/kg)組，從給藥7 min開始至115 min，肺部18F-甘草次酸的濃度明顯升高，為對(duì)照組的2.7倍，而其它器官?zèng)]有明顯的變化，印證了桔梗能夠引甘草上行的觀點(diǎn)。而在注射前一周每天灌胃給藥上述相同計(jì)量的桔?？傇碥?，注射當(dāng)天停止給藥，同樣觀察藥代分布變化，結(jié)果發(fā)

13、現(xiàn)幾乎沒有改變甘草次酸藥代分布的效果。因此推測(cè)，可以是藥物相互作用的原因改變了甘草次酸的藥代分布，具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
　　本論文采用了點(diǎn)擊化學(xué)、磁性捕獲、納米自組裝以及PET成像等重要的研究手段，分別對(duì)牛蒡子苷元的組織分布、細(xì)胞定位、以及靶點(diǎn)蛋白捕獲以及桔梗引甘草上行的機(jī)制等進(jìn)行了研究，初步建立了篩選和鑒定細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)蛋白，并通過生物信息學(xué)分析、分子對(duì)接和基于結(jié)構(gòu)的計(jì)算分析手段確證相應(yīng)的靶標(biāo)蛋白及其生物學(xué)功能，以及開展