鱖魚泛素活化酶、泛素結合酶基因的克隆、表達和功能.pdf

1、鱖魚(Siniperca chuatsi)是原產我國的淡水肉食魚類，具有較大經濟價值，已經成為我國重要的養(yǎng)殖品種。而近年來傳染性脾腎壞死病毒(infectious spleenand kidney necrosis virus，ISKNV)對鱖魚養(yǎng)殖造成了嚴重的經濟損失。為了研究病毒與宿主的相互作用，本論文針對與蛋白降解相關的泛素-蛋白酶體降解途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)中的泛素活化酶(ubi

2、quitin activaingenzyme，E1)、泛素結合酶(ubiquitin conjugating enzyme，E2)展開研究。 通過改良的簡并引物設計法，釣取出鱖魚細胞內兩基因的表達序列標簽(expressed sequence tag，EST)。利用快速擴增cDNA末端(rapid amplification ofcDNAends，RACE)技術，克隆得到了鱖魚E1、E2的全長cDNA序列。其中，E1的全長cDN

3、A含一個長達3174 bp的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼1057個氨基酸的蛋白質，預測分子量為117975.77 Da，等電點為5.46。所獲取E2的全長cDNA含一個444 bp的開放閱讀框，編碼147個氨基酸的蛋白質，預測分子量為16546.04 Da，等電點為7.78，屬于UBC4/5家族成員，含有進化保守的UBC結構域。根據所得序列，應用實時定量PCR技術，分析了E1、E2基因在健康鱖魚中的組

4、織分布，結果顯示E1和E2基因在被檢測的所有組織都有分布，均在血液中表達量最高，E1在腦中表達量最低，而E2在脾中表達量最低。進行了鱖魚E2基因的原核表達。將E2的ORF克隆于pET-32a(+)、pMal-c2X、pGEX-4T-1三種原核表達載體并分別在大腸桿菌BL21(DE3)和XL1-Blue中成功地高效表達了目的蛋白，融合蛋白可溶性較好并通過蛋白印跡實驗證實正確表達。為了進一步研究E2蛋白的功能，采用經典的體外泛素化實驗驗證其

5、活性。通過ISKNV所編碼的五個環(huán)指蛋白和此E2蛋白反應，發(fā)現65，66蛋白和它有較強作用；另外它還與鱖魚的一種含有HECT(homologous toE6-AP carboxyl terminus)結構域的E3蛋白有較強的泛素化反應。這些結果表明所獲得的鱖魚E2蛋白具有泛素結合酶的活性。這是在鱖魚中首次發(fā)現E1和E2基因，研究了它們在鱖魚中的組織分布情況，并首先證實了該E2蛋白具有泛素結合酶活性。本文為E1、E2以及UPP的進一步研究