細麗毛殼菌產(chǎn)α-葡聚糖酶的發(fā)酵工藝優(yōu)化.pdf

1、葡聚糖是甘蔗制糖過程中由于微生物滋生而產(chǎn)生的一種粘性多糖，其存在對白砂糖的生產(chǎn)造成了極大的危害。當前，消除葡聚糖的方法主要有物理法、化學法以及生物法，但是這些方法都存在難以克服的缺點。綜合現(xiàn)有的葡聚糖去除方式，在糖汁中添加α-葡聚糖酶是最安全、有效的方法。然而，該方法受制于α-葡聚糖酶存在酶活較低、成本偏高以及難以實現(xiàn)工業(yè)化應用等缺陷。因此，開發(fā)一種高效、成本低廉、綠色環(huán)保的α-葡聚糖酶變得至關(guān)重要。細麗毛殼菌是一種食品安全性菌株，該菌

2、體在發(fā)酵過程中可以生產(chǎn)α-葡聚糖酶，具有較大的應用潛力。由于細麗毛殼菌較強的菌體自絮凝性等原因，使得當前細麗毛殼菌發(fā)酵生產(chǎn)α-葡聚糖酶的活性較低，很大程度上限制了該酶在食品、藥品等領(lǐng)域的應用。本研究旨在對細麗毛殼菌發(fā)酵產(chǎn)酶工藝進行優(yōu)化，提高酶活以及產(chǎn)量，為實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。本課題主要研究內(nèi)容如下:
　　1.采用發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化策略，提高產(chǎn)酶效率
　　本課題對細麗毛殼菌發(fā)酵培養(yǎng)基以及工藝進行優(yōu)化，對發(fā)酵溫度、發(fā)酵轉(zhuǎn)速、氮源

3、的優(yōu)化選擇以及碳源與氮源的質(zhì)量比例等因素進行單因素實驗以及正交實驗，結(jié)果證明氮源選擇玉米漿代替酵母浸膏，碳源與氮源的質(zhì)量比例為1∶1，發(fā)酵溫度為29℃，發(fā)酵轉(zhuǎn)速為210 r/min時發(fā)酵液酶活達到172.8 U/mL，比起優(yōu)化前提高了68.1％。
　　2.在發(fā)酵過程中引入聲學技術(shù)，提高產(chǎn)酶效率
　　將超聲波技術(shù)引入細麗毛殼菌發(fā)酵過程中，通過單因素實驗研究不同超聲功率、超聲時間、超聲頻率對發(fā)酵的影響。研究發(fā)現(xiàn)低頻超聲場可顯著促

4、進α-葡聚糖酶的酶活以及產(chǎn)量，通過實驗證實最適超聲處理條件為:超聲功率300 W、超聲時間20 S/20 min、超聲頻率20 kHz，酶活從102.9 U/mL提高至193.4 U/mL，提高了87.9％。
　　3.采用二步誘導法及二步法發(fā)酵轉(zhuǎn)移菌體法，提高產(chǎn)酶效率
　　首先研究了細麗毛殼菌利用葡萄糖與葡聚糖兩種底物時，產(chǎn)酶量及菌體干重的變化。結(jié)果表明，單純葡萄糖作底物時菌體不產(chǎn)酶;以葡聚糖為底物時菌體可分泌α-葡聚糖酶，

5、然菌體生長速度較慢?；诖藢嶒灲Y(jié)果，設置了誘導發(fā)酵技術(shù)即發(fā)酵初期使用葡萄糖生長菌體，而后加入葡聚糖誘導產(chǎn)酶。結(jié)合酶活測定結(jié)果，確定了最佳誘導濃度為1％及最佳開始誘導時間為20 h，酶活為152.4 U/mL，比起對照組提高了49.3％，發(fā)酵周期縮短4h。
　　此外，研究設計了二步發(fā)酵轉(zhuǎn)移菌體法提高產(chǎn)酶效率，即首先使用葡萄糖發(fā)酵生長菌體，后收集菌體轉(zhuǎn)移至新鮮的葡聚糖發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵產(chǎn)酶。通過測定酶活變化以及生長曲線，結(jié)果表明轉(zhuǎn)移

6、菌體法效果較為顯著，此時酶活為200.1 U/mL，比起對照組提高了96.0％。
　　4.降低菌體自絮凝性，提高產(chǎn)酶效率
　　為降低菌體的自絮凝性，實驗過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的玻璃珠以提高菌體分散性。研究了不同的玻璃珠添加數(shù)量、添加時間以及直徑對菌體形態(tài)及產(chǎn)酶效率的影響。實驗結(jié)果表明當發(fā)酵12h時向25 mL發(fā)酵液加入直徑為5mm且添加密度為10顆/25 mL的玻璃珠后酶活可以達到145.8 U/mL，比起未添加玻璃珠