應激與“上火”——廣東涼茶作用機理與物質(zhì)基礎研究.pdf

1、本論文闡述了“上火”是機體對應激負荷在心理和生理過程中產(chǎn)生的一種不協(xié)調(diào)的應激反應，是一種超越生理調(diào)節(jié)范圍內(nèi)身心疲勞的表現(xiàn)。從“上火”到形成疾病是一種涉及中樞神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)的應激反應過程。本文主要研究內(nèi)容為以應激負荷模擬大鼠和小鼠的“上火”狀態(tài)，從動物整體水平及分子生物學水平研究“上火”的科學內(nèi)涵；并通過研究嶺南瀉火名方廣東涼茶的抗應激藥理活性及其作用機制，力圖闡明廣東涼茶“清熱瀉火”作用機理；同時，建立廣東涼茶的HPLC指紋圖譜

2、，并采用開放柱層析，中低壓液相色譜(MPLC)以及高效液相色譜(HPLC)等適當?shù)姆蛛x手段獲得活性單體，確定相應的作用物質(zhì)基礎，提高廣東涼茶質(zhì)量標準。 首先，本研究以應激負荷模擬了大鼠和小鼠“上火”狀態(tài)，論證了“上火”與應激導致的機體中樞神經(jīng)遞質(zhì)變化、免疫功能下降、器官功能衰竭及糖脂代謝紊亂相關。并在此基礎上，系統(tǒng)研究廣東涼茶抗應激藥理活性，實驗從廣東涼茶對自發(fā)轉籠運動應激負荷大鼠行為及中樞神經(jīng)遞質(zhì)的影響，對拘束應激負荷誘發(fā)小鼠

3、免疫機能低下的影響，對應激狀態(tài)下肝損傷及應激性炎癥的影響，對應激性糖代謝紊亂的改善作用，以及對應激性脂代謝紊亂的改善作用等幾個方面，評價了廣東涼茶通過改善機體應激狀態(tài)與防治疾病之間的關系，旨在闡明廣東涼茶藥理活性。實驗結果顯示，廣東涼茶對轉籠應激負荷大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和5-HIAA水平下降有一定的改善作用，能顯著降低轉籠應激負荷大鼠大腦皮質(zhì)丙二醛(MDA)水平，并顯著提高大腦皮質(zhì)的抗氧化能力指數(shù)(ORAC)。廣東涼茶能減輕拘束應激

4、負荷引起的免疫器官指數(shù)下降、緩解脾臟細胞總數(shù)減少、改善T淋巴細胞亞群比例紊亂、增加NK細胞及CTL殺傷活性等免疫學指標。淋巴細胞內(nèi)氧化狀態(tài)初步研究結果提示廣東涼茶對拘束應激負荷引起的免疫功能低下的改善作用可能與廣東涼茶提高拘束應激負荷小鼠脾細胞的抗氧化能力，并降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA)的含量有關。廣東涼茶對拘束負荷誘發(fā)小鼠氧化應激性炎癥及肝損傷有明顯的改善作用，其改善作用可能是通過清除體內(nèi)自由基和防止脂質(zhì)過氧化實現(xiàn)的。此外，我們也發(fā)現(xiàn)

5、廣東涼茶能提高拘束應激負荷小鼠口服葡萄糖的血糖消除速率，并降低應激負荷小鼠血漿酮體水平和促進其肝糖原的合成能力，加速糖能源的利用，提高機體的耐糖能力，調(diào)節(jié)應激性糖代謝紊亂。廣東涼茶能提高拘束應激負荷小鼠的血漿甘油三酯(TG)消除速率，同時提高腸系膜脂肪酶(LPL)的活性，加速脂肪能源的利用，增加動物的脂肪耐受能力。以上實驗結果表明，廣東涼茶“瀉火”的作用機理與廣東涼茶對機體應激負荷狀態(tài)的改善作用有關。 在廣東涼茶能有效改善機體應

6、激負荷狀態(tài)的藥理活性研究基礎上，以廣東涼茶能改善拘束負荷誘發(fā)小鼠免疫機能低下這一實驗結果為例，本研究進一步探討廣東涼茶改善機體應激負荷狀態(tài)的作用機制。實驗首先通過檢測拘束負荷小鼠脾臟淋巴細胞內(nèi)的MDA和ORAC水平，確定細胞內(nèi)氧化及抗氧化狀態(tài)。然后，通過流式細胞術熒光染料特異性標記檢測拘束負荷小鼠脾臟淋巴細胞內(nèi)的含氮類自由基(RNS)及活性氧(ROS)的水平。同時，測定小鼠脾細胞內(nèi)自由基清除系統(tǒng)的關鍵酶超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽

7、轉移酶(GPX)的活性。此外，我們還從基因水平檢測自由基產(chǎn)生的關鍵酶一氧化氮合酶(iNOS)和自由基消除的關鍵酶SOD的mRNA表達水平的變化。本研究通過對上述細胞內(nèi)的自由基產(chǎn)生和消除通路中各指標的測定，探討應激負荷造成機體損傷的氧化應激機制，進而揭示廣東涼茶能改善應激負荷狀態(tài)的科學內(nèi)涵。實驗結果發(fā)現(xiàn)，拘束負荷小鼠脾臟淋巴細胞內(nèi)ROS和RNS含量顯著增加，表明拘束負荷對機體造成的應激損傷可能和體內(nèi)毒害自由基的過渡產(chǎn)生有關。RT-PCR對

8、一iNOSmRNA表達分析結果進一步證實，拘束負荷能明顯提高細胞內(nèi)iNOSmRNA的表達水平，表明應激負荷小鼠體內(nèi)含氮類毒性自由基的大量產(chǎn)生可能是應激負荷激活體內(nèi)相關基因的表達有關。拘束負荷組小鼠細胞內(nèi)自由基消除鏈式反應中關鍵酶SOD和GPX的活性及相關基因的表達異常，同時小分子抗氧化物質(zhì)GSH含量減少，結果表明應激負荷時自由基消除鏈式反應的關鍵酶活性紊亂及重要小分子抗氧化物質(zhì)的耗竭進而引起細胞內(nèi)的氧化應激損傷可能也是機體應激損傷的機制

9、之一。廣東涼茶通過調(diào)節(jié)拘束負荷小鼠體內(nèi)RNS及ROS的產(chǎn)生，減少毒害作用較強的自由基·ONOO-及·OH的過度產(chǎn)生，同時調(diào)節(jié)清除自由基的鏈式反應中關鍵酶SOD和GPX的活性及相關基因的表達，保護小分子抗氧化物質(zhì)GSH的耗竭。因此，廣東涼茶有調(diào)節(jié)應激負荷狀態(tài)下機體氧化平衡的作用，通過緩解氧化應激水平繼而改善機體的應激狀態(tài)。 在以上廣東涼茶“瀉火”作用機理和機制的研究基礎上，本研究通過不同色譜條件摸索建立了廣東涼茶的HPLC指紋圖譜

10、，以確定廣東涼茶作用物質(zhì)基礎。并利用多種現(xiàn)代色譜分離手段(包括大孔樹脂DiaionHP-20，ODS，SephadexLH-20柱色譜，HPLC等)，富集并分離得到了HPLC指紋圖譜中的8個主要色譜峰，占總峰面積的93.63％。通過理化常數(shù)和現(xiàn)代波譜學手段(MS、NMR)，結合文獻相關數(shù)據(jù)，鑒定了它們的化學結構為Gallicacid，Protocatechuicacid，(+)-Catechin，4-Hydroxybenzoicacid

11、，Caffeicacid，Ellagicacid-4-O-xylopyranoside，Isoquercitrin，Ellagicacid。通過體外活性測試，測定了所分離得到的8個主要色譜峰化合物對自由基的清除能力(用抗氧化能力指數(shù)ORAC值表示)以及對應激負荷小鼠脾臟淋巴細胞產(chǎn)生活性氧的自由基鏈式反應的調(diào)節(jié)作用(測定對ROS的抑制率)，結果發(fā)現(xiàn)多數(shù)化合物為活性成分，且活性與對照用藥物維生素C相當或者更強。十批次涼茶產(chǎn)品HPLC分析研究

12、結果顯示廣東涼茶HPLC指紋圖譜的色譜行為穩(wěn)定，不同批次產(chǎn)品間色譜圖的相似度達到0.987以上，已經(jīng)初步建立了一套與活性相關的多組分/指紋圖譜控制產(chǎn)品質(zhì)量的方法。 綜上所述，“上火”是一種應激性反應，是機體受到應激原刺激引起的一種為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的適應能力的超負荷狀態(tài)。應激負荷能導致機體過氧化損傷，破環(huán)機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，進而導致動物的行為、神經(jīng)、免疫、糖脂代謝等功能的改變，這可能是“上火”發(fā)生的主要原因。廣東涼茶則通過調(diào)節(jié)應激負荷