低pH孵放法滅活生物制品中慢嗜性小鼠白血病病毒的方法學研究.pdf

1、生物制品包括血液制品、基因制品、病毒類疫苗等，為了提高生物制品臨床使用的安全性，生產(chǎn)工藝要具有一定的去除或滅活部分病毒的能力，生產(chǎn)過程中應有特定的去除或滅活病毒的方法。重組融合蛋白屬于基因制品的一種，目前上市銷售的重組融合蛋白類生物制品包括TNF-α、IFN-γ、IL-18、IL-12等，此類蛋白主要以中國倉鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）作為表達載體。目前，CHO細胞表達抗體藥物已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化。然而，CHO

2、細胞內(nèi)本身存在內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，這一結(jié)論已經(jīng)得到證實;但這種內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒對人類不具有致病性。盡管這種內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒對于人類是非致病性的，但采用CHO細胞作為藥用蛋白質(zhì)的表達載體，其分泌的蛋白質(zhì)對于人用藥的安全性仍然具有的一定潛在風險。因此，各國新藥研發(fā)相關法規(guī)要求對于CHO細胞來源的藥用蛋白質(zhì)，其生產(chǎn)工藝中必須具備病毒去除或滅活工藝，而且，必須對該工藝在實驗室進行病毒去除或滅活的驗證檢驗。我國相關生物制品生產(chǎn)廠家及生產(chǎn)品種逐年增多

3、，但實驗室驗證研究的方法國內(nèi)目前尚未建立，需在美國進行試驗，因而時間長、費用高成為制約國內(nèi)相關新藥研發(fā)的關鍵問題。本課題根據(jù)SFDA相關法規(guī)和技術要求，建立此類蛋白藥物的病毒滅活驗證方法，以填補國內(nèi)空白。
　　 此外，本課題中建立的異嗜性小鼠白血病病毒(X-MulV)致貓神經(jīng)星形膠質(zhì)細胞（PG-4）產(chǎn)生病變效應的體外模型，不僅可以用于生物制品中病毒滅活驗證檢驗，亦可用于抗逆轉(zhuǎn)錄病毒新藥的篩選及藥效學評價。
　　 美國FD

4、A及我國SFDA要求:對于CHO細胞來源的重組蛋白在低pH生產(chǎn)工藝的驗證性試驗中，采用X-MulV作為CHO細胞內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的指示病毒（又稱作模擬病毒、替代病毒），建立低pH孵放法病毒滅活驗證方法。
　　 本課題共分三個部分進行研究:
　　 一、X-MulV體外培養(yǎng)及活性評價體系的建立
　　 目前國外研究者采用Mus.Dunni細胞對X-MulV進行傳代，由于該細胞株在國內(nèi)即為少見，同時考慮到X-MulV能夠

5、在非小鼠細胞系生長的特點，我們選擇以CHO細胞作為X-MulV的傳代細胞，通過SYBR Green熒光定量聚合酶連反應(SYBR Green real-time PCR assay)，以gag基因作為靶基因，定量X-MulV在CHO細胞中生長2～7天的相對表達量，并通過病毒感染性試驗(PG-4細胞空斑試驗)確定病毒數(shù)量顯著增加時間點的病毒滴度。
　　 結(jié)果顯示:分別以培養(yǎng)時間作為橫坐標、以指示病毒gag基因RNA的相對表達量作為

6、縱坐標，繪制gag基因RNA相對表達量隨時間變化的曲線。曲線顯示:gag基因在CHO細胞中生長2～7天的生長曲線符合指數(shù)形式，指數(shù)方程擬合相關系數(shù)R2=0.9125，生長第7天的數(shù)量比第2天顯著增長(p＜0.01)，是第2天的13.89倍。
　　 經(jīng)CHO細胞傳代培養(yǎng)7天的X-MulV懸液，其在指示細胞PG-4上的病毒滴度為8.78±0.25 log10PFU/mL。病毒滅活方法指導原則中規(guī)定:作為指示病毒的病毒，其病毒滴度必須

7、達到7.0 log10以上。
　　 因此，以CHO細胞作為X-MulV的傳代細胞，經(jīng)培養(yǎng)7天得到的病毒懸液能夠用于病毒滅活驗證試驗。
　　 二、低pH法滅活生物制品中X-MulV方法的建立
　　 1.緩沖體系的建立:在滅活驗證試驗中，模擬重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝，以Tris-堿-檸檬酸緩沖液體系作為樣本緩沖液，將樣本緩沖液與X-MulV儲備液以9∶1體積比混勻后，進行病毒滅活驗證試驗。
　　 2.檢測指標:以

8、病毒滴度作為檢測指標，當降低的病毒滴度大于4.0 log10PFU視為有效滅活。
　　 3.滅活參數(shù)考察:包括pH值、滅活溫度、滅活時間以及蛋白質(zhì)濃度對滅活效果的影響。滅活試驗中設置不同因素、不同水平參數(shù)如下:滅活pH值:3.00、3.50、4.00以及5.00;滅活溫度:4℃、10℃、20℃以及25℃;滅活時間:2h、4h、6h、8h以及10h;蛋白質(zhì)濃度（以卵清白蛋白作為模擬蛋白，OVA）:0 mg/mL、1.0 mg/mL

9、、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、6.0 mg/mL、7.0 mg/mL、8.0 mg/mL、9.0 mg/mL以及10.0 mg/mL。將不同因素、不同水平按照排列組合的方式組合后，分別進行病毒滅活驗證試驗。
　　 對所有得到的殘余病毒滴度進行統(tǒng)計學分析，通過正交分析主成分分析得出:不同因素對病毒滴度的影響大小依次是:pH＞溫度＞時間;pH值和溫度對病毒滴度有顯著的影響(p＜0.

10、01)，時間不具有顯著性影響(p=0.264);通過正交分析交互作用分析得出:溫度和時間之間的交互作用對病毒滴度具有顯著性影響(p=0.016);通過正交分析篩選出的最優(yōu)滅活條件為:pH3.50、4℃、4h。多元線性回歸分析顯示:pH值能夠顯著影響病毒滴度(p＜0.01)，溫度能夠影響病毒滴度，但影響不具有顯著性(p=0.081)，時間對病毒滴度沒有影響(p=0.941)。結(jié)合上述分析結(jié)果，同時考慮到實際滅活工藝在常溫條件下進行;因此，

11、在考察蛋白質(zhì)濃度對病毒滴度的影響時，在pH3.50、4h一致的前提下，同時考察4℃和25℃的滅活效度。經(jīng)滅活后，蛋白質(zhì)濃度從0 mg/mL～10.0 mg/mL范圍內(nèi)，4℃組和25℃組病毒滴度降低分別大于4.1 log10PFU和4.7 log10PFU;且25℃組樣本病毒降低滴度基本大于5.0 log10PFU。
　　 在此基礎上，進行pH值、溫度及時間因素允許范圍的考察。通過病毒感染性試驗，當滅活溫度為25℃、孵育4h時，p

12、H值在3.60～3.90范圍內(nèi)，X-MulV病毒滴度降低均大于5.0 log10PFU;當pH為3.60、孵育4h時，溫度在23℃、24℃、25℃、26℃以及27℃范圍時，X-MulV病毒滴度降低均大于5.0 log10PFU;當pH值為3.60、孵育溫度為25℃時，滅活0～180 min不能有效滅活X-MulV，滅活240 min能夠有效滅活X-MulV。通過參數(shù)允許變化范圍的考察，結(jié)合相關文獻報道:pH3.50時，生物制品會有少量損

13、失。我們將最優(yōu)滅活條件設為:pH3.60、25℃及4h。
　　 4.逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測:為了進一步評價滅活效度，采用產(chǎn)物增強的逆轉(zhuǎn)錄酶反應法（簡稱為PERT法）考察X-MulV滅活前后逆轉(zhuǎn)錄酶活性的變化。結(jié)果顯示:以MMLV作為已知濃度的標準逆轉(zhuǎn)錄酶，通過逆轉(zhuǎn)錄酶濃度-CT值標準曲線，計算樣本中逆轉(zhuǎn)錄酶的含量。經(jīng)SYBR Green熒光定量PCR反應檢測逆轉(zhuǎn)錄酶活性，經(jīng)pH3.50、4h滅活后，逆轉(zhuǎn)錄酶含量比未滅活樣本降低兩個數(shù)量

14、級，具有顯著性差異(p＜0.01)，且4℃組與25℃組之間沒有顯著性差異(p＞0.05)。
　　 5.低pH對生物制品活性的影響:選擇L929細胞株作為靶細胞，采用MTT比色法檢測rhTNF-α的對L929細胞的殺傷活性。將rhTNF-α經(jīng)pH3.60、25℃孵育4h后，其殺傷L929細胞活性與中性rhTNF-α相比，未發(fā)生變化。
　　 6.低pH對病毒包膜基因的影響:利用傳統(tǒng)聚合酶鏈式反應，考察X-MulV在有效滅活前

15、后，包膜基因env3'末端1626～1930位點片段的擴增情況。X-MulV經(jīng)pH3.60、25℃滅活4h后，env3'末端305 bp片段未擴增出，而陽性對照中該片段條帶清晰，且亮度高。
　　 三、試驗方法的實際應用
　　 采用pH3.60、25℃、4h的滅活條件對百奧泰（廣州）生物科技有限公司提供的注射用rhTNF-α融合蛋白進行X-MulV的滅活驗證，結(jié)果顯示病毒滴度降低4.0 log10以上，說明此條件能夠有效滅

16、活指示病毒X-MulV，符合國際規(guī)定的病毒滴度降低大于4.0 log10的要求。
　　 通過以上研究，我們得出結(jié)論:
　　 1.以CHO細胞作為X-MulV的傳代載體，培養(yǎng)7天，獲得的X-MulV病毒懸液，在PG-4細胞中的病毒滴度能夠達到7.0 log10PFU以上，符合生物制品病毒滅活指導原則關于指示病毒的要求;
　　 2.采用pH3.60、25℃、4h滅活CHO細胞來源的人重組融合TNF-α蛋白藥物中指示病