植物乳桿菌ZJ316黏附蛋白基因的克隆及在大腸桿菌中的表達.pdf

1、乳酸菌是人和動物腸道內的優(yōu)勢微生物菌群，益生性的乳酸菌在機體內有調節(jié)人和動物體微生態(tài)平衡，抑制并殺死致病菌，增強機體免疫力的作用。黏附是乳酸菌定植于宿主腸道發(fā)揮各種生理作用的前提。研究乳酸菌的黏附機制對于微生態(tài)制劑的開發(fā)應用具有重要的研究意義。
　　 本研究以本實驗室保存的從嬰兒糞便中篩選得到的一株產細菌素的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum ZJ316）為研究對象。采用微生物黏著碳氫化合物法(MATH)

2、測定了三株乳酸菌（植物乳桿菌ZJ316、植物乳桿菌ZJ22、屎腸球菌ZJ19）疏水性、表面電荷和自聚合能力等表面性質，并且進行了酵母凝集實驗測定乳酸菌的糖類專一性。結果顯示，植物乳桿菌ZJ316的疏水性最高(83.67±1.13)。酵母凝集實驗表明植物乳桿菌ZJ316的酵母凝集度為32，加入了D-甘露糖和甲基-α-D-甘露糖苷的的實驗組，乳酸菌的黏附力下降，說明植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumZJ316）的黏附

3、與特異性黏附中的甘露糖結合相關聯。
　　 以Lactobacillus plantarum WCFS1表層黏附蛋白Slp2588、黏液黏附蛋白Muc2486黏附蛋白基因序列(1062815)、(1062646)進行引物設計，在Lactobacillus plantarumZJ316中，克隆黏附基因并進行測序。測序結果為:基因片段slp2588A長度為1618 bp，基因片段muc2486A長度為3018 bp。在NCBI網站用B

4、LAST軟件相似性比較，結果顯示，基因片段slp2588A和Lactobacillus plantarum WCFS1中的黏附基因slp2588相似性為98％;基因片段muc2486A和L.plantarumWCFS1中的黏附基因muc2486相似性為99％。因此，我們初步判斷在植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ZJ316基因組中存在表層黏附蛋白Slp2588和粘液黏附蛋白Muc2486基因序列。
　　

5、 將含有相同黏性末端的目的片段（slp2588A、muc2486A）與質粒載體(pET-28a)體外重組構建原核表達載體。將重組載體轉入BL21(DE3)中，IPTG誘導表達，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示有目的蛋白條帶。離心收集重組體菌體，超聲波破碎離心，發(fā)現沉淀中含有目的蛋白，說明目的蛋白以包含體的形式表達，沒有活性，需要復性才能分離純化。將兩個目的蛋白的包含體進行酵母凝集實驗，發(fā)現酵母凝集能力更強。說明構建大腸桿菌BL21(DE3