銅抗性全細胞傳感器的構建和表達.pdf

1、{，妻避l竹學校代碼： 1 0 1 3 5論文分類號：X 8 3 0 ．2學 號：2 0 0 8 4 0 1 6 0 2 0研究生類別： 全日制幽喜之解貉犬謦碩士學位論文銅抗性全細胞傳感器的構建和表達U o n s t r u c t i o na n n e X D r e s s l o no IU o p p e r r e s l s t a n c eJ 叫 ．● ' ● n J 叫 ●w h o l e ．．c e

2、l ls e n s o r s學科門類：一級學科：學科、專業(yè)：研究方向：申請人姓名：指導教師姓名：二。一一年四月十日l聾●一J礦，：_-．■b．▲歹中文摘要㈣㈣I ㈣Ir | I I l | l ril㈣l 1 1 1 1 1 |Y 1 8 9 1 。9 。1 ‘4 。利用聚合酶列式反應( P C R ) 從大腸桿菌中擴增到類銅的特異性啟動子C o p A 和銅調(diào)控蛋白C u e R 基因，以綠色熒光蛋白( G F P ) 為報告基因

3、，p G E M 為載體，構建成離子誘導表達質粒C G P N P C T ，轉．化入大腸桿菌D H 5 a 宿主菌體中，加入銅離子誘導表達，測定其對重金屬銅及其衍生物的耐受性。成功制備了抗重金屬銅的工程菌株，研究了工程菌株的熒光強度與銅離子濃度和誘導時間的關系，以及工程菌的性質，以考察工程菌．株用于快速檢測重金屬銅的可行性。工程菌株的研究結果如下：1 ．以含C G P N P C T 質粒的D H 5 0 t 在無銅誘導時綠色熒光蛋白

4、的表達量為對照，加入C u 2 + 誘導4 h 后，測定表達熒光的吸收光譜，可見在4 8 0 —5 2 0 n m 有吸收峰。·2 ．工程菌D H 5 a ( C G P N P C T ) 在培養(yǎng)基中加入不同終濃度的C u 2 +誘導4 h 發(fā)現(xiàn)，隨著銅離子( C u 2 + ) 濃度的增加，誘導的熒光表達量逐漸上升，銅離子在1 ．5 m m o l ／L 時達到最高值，然后下降，3 m m o l ／L達到平衡，在0 ,

5、- - - ，4m m o l ／L 范圍內(nèi)，．熒光強度和離子濃度呈正相關。3 ．工程菌D H 5 0 t ( C G P N P C T ) 在培養(yǎng)基中加入不同濃度的C u 2 +做誘導，在O ．1 2 個小時的時間段內(nèi)每兩個小時取樣測定熒光值，．數(shù)據(jù)顯示，熒光值隨C u 2 + 濃度增大呈明顯上升趨勢。銅離子( C u 2 + ) 濃度相同時，隨著時間梯度的變化，熒光值穩(wěn)定上升，與時間呈正比。4 ．分別采用6 種重金屬離子( C u

6、 2 + 、A s 5 + 、C d 2 + 、C r 3 + 、H 9 2 + 、P b 2 + ) 對工程菌株進行誘導，測定熒光強度考察工程菌株對銅離子的特異性。發(fā)現(xiàn)，工程菌株對銅以外的重金屬離子基本沒有響應，說明工程菌株對銅離子具有較強的特異性。上述結果表明，以綠色熒光蛋白基因為報告基因的工程菌株D H 5 a ( C G P N P C T ) 有望建立起一種方便快捷的重金屬銅的檢測方法一微生物全細胞傳感器法，具有很高的應用價值