特異性抗體定量檢測(cè)葡聚糖方法的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、在甘蔗制糖工業(yè)中出現(xiàn)的葡聚糖主要為α-葡聚糖(又稱右旋糖酐,以下簡(jiǎn)稱葡聚糖),是腸膜明串珠菌屬產(chǎn)生的葡聚糖蔗糖酶將蔗糖轉(zhuǎn)化為α-D吡喃葡萄糖(主要是α-(1→6)結(jié)構(gòu)的葡萄糖)高分子聚合物多糖,其對(duì)制糖生產(chǎn)有較大影響,產(chǎn)生增大糖液的粘度,降低沉降速度、糖液的過(guò)濾性,使蔗糖結(jié)晶時(shí)生成異常形態(tài)的晶體等問(wèn)題,因此,葡聚糖的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)成為糖廠生產(chǎn)控制的一個(gè)重要技術(shù)。目前,葡聚糖檢測(cè)的主要方法是有著檢測(cè)過(guò)程操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度較低以

2、及不適用于不同糖品等缺點(diǎn)化學(xué)分析方法。因此,建立一種方便快速、準(zhǔn)確度高,穩(wěn)定性好、適用于各種樣品中葡聚糖的檢測(cè)方法勢(shì)在必行。本論文研究簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、價(jià)格合理的免疫學(xué)方法來(lái)測(cè)定葡聚糖的含量,使之適用于甘蔗制糖工業(yè)生產(chǎn)中的各種糖品中葡聚糖,對(duì)整個(gè)生產(chǎn)線中葡聚糖含量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),為提高生產(chǎn)管理效率提供依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
   (1)利用已制備好的抗葡聚糖單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞,接種到Balb/C小鼠腹腔內(nèi),產(chǎn)生含抗葡聚糖

3、單克隆抗體腹水;收集腹水,經(jīng)純化后得到純化抗體;摸索其凍干條件,進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn),為葡聚糖免疫學(xué)檢測(cè)國(guó)產(chǎn)試劑盒中抗體的保存打下基礎(chǔ)。結(jié)果表明:通過(guò)純化,抗體純度可達(dá)到95%以上,葡聚糖特異性抗體的最佳凍干保護(hù)劑是濃度為10%的蔗糖,凍干后-20℃保存360天抗體效價(jià)變化不大。
   (2)研究比較《原糖》(GB15103-2006)國(guó)標(biāo)法和免疫比濁法測(cè)定葡聚糖的方法,探討了不同分子量葡聚糖、反應(yīng)時(shí)間對(duì)各自標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的影響。結(jié)果表

4、明:兩種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線均受葡聚糖分子量大小的影響,葡聚糖分子量大時(shí)影響較小,葡聚糖分子量小時(shí),影響較大:最佳反應(yīng)時(shí)間分別是20min±10s,1min50s。確定測(cè)試條件后,研究這兩種方法檢測(cè)葡聚糖T-500線性范圍、檢測(cè)下限、分辨率、準(zhǔn)確度及重復(fù)性等參數(shù)。并對(duì)白砂糖、原糖、蔗汁樣品進(jìn)行加標(biāo)回收及重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果表明:當(dāng)蔗糖濃度為16%時(shí),原糖國(guó)標(biāo)法測(cè)定葡聚糖T-500標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.5206x-0.0035,線性范圍25-1000m

5、g/kg,檢測(cè)下限13.4mg/kg,分辨率是25mg/kg,檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品糖液重復(fù)性RSD=0.84%,標(biāo)準(zhǔn)品糖液加標(biāo)平均回收率為95.5%,檢測(cè)部分樣品重復(fù)性平均RSD(%)=1.85%,樣品平均加標(biāo)回收率93.6%;免疫比濁法測(cè)定葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為T(mén)-500y=0.0937x+0.0266,線性范圍是51.9~3750.0mg/kg,檢測(cè)下限21.75mg/kg,分辨率為51.9mg/kg,檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品糖液重復(fù)性RSD=0.38%,加標(biāo)平

6、均回收率為100%,檢測(cè)部分樣品重復(fù)性RSD(%)=0.52%,平均加標(biāo)回收率為99.9%,檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品糖液高度一致??偟膩?lái)說(shuō)免疫比濁法要優(yōu)于《原糖》(GB15103-2006)國(guó)標(biāo)法。
   (3)研究抗體用量少的免疫比色法反應(yīng)時(shí)間和加樣量,探討樣品顏色對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響,并確定其線性范圍、檢測(cè)下限、精密度和重復(fù)性等參數(shù),之后又對(duì)白砂糖、原糖、蔗汁樣品進(jìn)行加標(biāo)回收及重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果表明:最佳反應(yīng)時(shí)間13min、100μL抗體

7、最佳加樣量1μL,檢測(cè)葡聚糖T-500線性范圍是312.5~5000.0mg/kg,檢測(cè)下限是221.3mg/kg,標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)性平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)=0.36,葡聚糖T-500標(biāo)準(zhǔn)品糖液平均加標(biāo)回收率(%)=98.2%,略低于免疫比濁法,部分樣品重復(fù)性平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)=0.56,另外兩種樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)的平均加標(biāo)回收率(%)=98.6%,說(shuō)明樣品測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)品糖液高度一致。因此利用酶標(biāo)儀的免疫比色法延續(xù)了免疫比濁法準(zhǔn)確

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