海洋芽孢桿菌B-9987基因組文庫的構建及Macrolactins生物合成基因簇的克隆與鑒定.pdf

1、海洋芽孢桿菌B-9987(Bacillus marinus)分離于我國渤海潮問帶植物鹽地堿蓬(Suaeda salsa)的根部,能夠產生豐富的Macrolactins類化合物。Macrolactins是一系列24元大環(huán)內酯類化合物,主要分離自Actinomadura sp.和Bacillus sp.等海洋來源的微生物之中,具有廣泛的抗菌、抗病毒和抗腫瘤等生物學活性。本論文以海洋芽孢桿菌B-9987為研究對象,主要開展了以下研究工作:

2、r>　　首先,成功構建了海洋芽孢桿菌B-9987的基因組文庫。從B-9987中提取基因組DNA,經過Sau3AI部分酶切,脫磷,回收40kb左右的DNA片段,與經XbaI酶切并脫磷,再用BamHI處理的載體SuperCosl相連接,連接產物經包裝蛋白包裝,然后侵染宿主細胞Ecoli Trans10,構建成海洋芽孢桿菌B-9987的基因組文庫。對該文庫進行了質量鑒定,結果表明:文庫的效價達5×105 cfu/mL,共得到2×104個陽性克

3、隆子,平均插入長度為35kb,插入率接近100％,覆蓋率為4.4。所建文庫的各項指標均達到要求,克隆子分裝保存于-80℃?；蚪M文庫的構建為次級代謝產物生物合成基因簇的克隆,以及異源表達奠定了基礎。
　　其次,對海洋芽孢桿菌B-9987的發(fā)酵條件與收獲時間進行了摸索與優(yōu)化。結果表明:采用兩步法,以LB培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基,在28℃,200rpm振蕩培養(yǎng)16 h,獲得種子液,將種子按10％接種量接種至50/250mL三角瓶的Land

4、y發(fā)酵培養(yǎng)基中,同樣條件下再培養(yǎng)12 h,為合適收獲時間。
　　接著,對海洋芽孢桿菌B-9987中Macrolactins生物合成基因簇進行了克隆與生物信息學分析。研究結果表明,Macrolactins的骨架是由bmmA-I(bmb1676-1683)編碼的8個聚酮合酶以丙二酰CoA為延伸單位,經11輪克萊森縮合反應催化組裝而成,其中bmmA(bmb1676)編碼了反式-?；D移酶(trans-AT)。本論文構建了用于bmmA雙交