卷煙煙氣誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激研究.pdf

1、卷煙煙氣是一種復(fù)雜的氧化性氣溶膠，當(dāng)其暴露機(jī)體時會影響相關(guān)靶組織的氧化還原平衡，誘發(fā)氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)，并最終導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。因此研究卷煙煙氣氧化應(yīng)激對評價(jià)卷煙煙氣的危害性具有重要意義。本研究分別在卷煙煙氣總粒相物(TPM)染毒和全煙氣暴露兩種實(shí)驗(yàn)條件下，研究了卷煙煙氣TPM和全煙氣誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激作用，建立了卷煙煙氣TPM和全煙氣誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激測定方法。主要研究內(nèi)容如下：
　?。?）卷煙煙氣TPM誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激測定

2、方法的建立。
　　a.卷煙煙氣TPM染毒劑量的優(yōu)化：選用3R4F參比卷煙TPM染毒支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B和肺腺癌細(xì)胞A549，通過中性紅細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(NRU)分別篩選出了兩種細(xì)胞存活率在70％以上的 TPM染毒劑量（BEAS-2B細(xì)胞，20和40μg/mL;A549細(xì)胞,75和100μg/mL）作為后續(xù)氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測的TPM染毒劑量。
　　b.卷煙煙氣TPM染毒時間的優(yōu)化：選用3R4F參比卷煙TPM以75和100μg

3、/mL染毒A549細(xì)胞，分別檢測染毒4和24 h后細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)（谷胱甘肽還原態(tài)/氧化態(tài)（GSH/GSSG）、丙二醛（MDA）、4-羥基壬稀醛（HNE）、細(xì)胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）和8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG））濃度的變化。結(jié)果顯示在該條件下TPM染毒24 h適宜檢測細(xì)胞的氧化應(yīng)激。
　　c.卷煙煙氣TPM誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞的氧化應(yīng)激：選用3R4F參比卷煙TPM分別以20和40μg/mL，75和

4、100μg/mL染毒BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞，經(jīng)過24 h染毒后分別對兩種細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)（GSH/GSSG、MDA、HNE、EC-SOD和8-OHdG）進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)，GSH/GSSG顯著降低，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA和HNE分別顯著增加，抗氧化酶EC-SOD顯著增加，DNA氧化產(chǎn)物8-OHdG顯著性增加，表明TPM誘導(dǎo)了細(xì)胞氧化應(yīng)激。此外BEAS-2B細(xì)胞相對于 A549細(xì)胞對 TPM誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激指標(biāo) GSH

5、/GSSG、MDA、HNE、EC-SOD和8-OHdG濃度的變化較為敏感。
　　d.外源性抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）對TPM誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響：選用A549細(xì)胞，經(jīng)抗氧化劑NAC(1 mM,2 h)預(yù)處理后以75和100μg/mL3R4F參比卷煙TPM染毒24 h，檢測細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)。結(jié)果證實(shí)：TPM確實(shí)誘導(dǎo)了細(xì)胞的氧化應(yīng)激，且NAC對TPM誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有一定的保護(hù)作用。
　　e.比較不同卷煙樣品TPM誘導(dǎo)

6、細(xì)胞的氧化應(yīng)激：選用5種不同卷煙TPM樣品以100μg/mL染毒A549細(xì)胞，24 h后檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)，結(jié)果顯示：不同卷煙煙氣TPM樣品誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生了不同程度的氧化損傷，且GSH/GSSG、MDA、EC-SOD和8-OHdG的檢測結(jié)果較明顯的表現(xiàn)出不同樣品間的差異，且EC-SOD和8-OHdG的檢測結(jié)果趨勢較為一致。
　?。?）全煙氣誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激測定方法的建立。
　　a.全煙氣染毒劑量的優(yōu)化：選用BEAS-2B細(xì)胞和A

7、549細(xì)胞，分別以優(yōu)化的細(xì)胞接種密度（BEAS-2B，1.0×105；A549，4.0×104個/Transwell）接種于12孔板24 h后，進(jìn)行全煙氣暴露細(xì)胞，以潔凈空氣的暴露作為陰性對照組。經(jīng)過三種細(xì)胞毒性檢測試驗(yàn)（NRU、噻唑藍(lán)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT）和乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性試驗(yàn)（LDH）），分別篩選出兩種細(xì)胞存活率在70%以上的煙氣暴露劑量（BEAS-2B細(xì)胞，0.12%和0.27%;A549細(xì)胞,0.23%和0.67%）作為后續(xù)氧

8、化應(yīng)激指標(biāo)檢測的全煙氣暴露劑量。
　　b.全煙氣誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞的氧化應(yīng)激：選用3R4F參比卷煙，在優(yōu)化的細(xì)胞暴露條件下，分別對BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞進(jìn)行全煙氣暴露，并通過檢測 GSH/GSSG、MDA、HNE、EC-SOD、8-OHdG、IL-8和 IL-6的變化，研究全煙氣誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激。結(jié)果顯示：全煙氣暴露后細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG顯著降低，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA和HNE分別顯著增加，抗氧化酶E