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文檔簡介
1、視黃醇結合蛋白(RBP)對肝臟、腎臟等疾病的診斷治療及預后監(jiān)測具有重要意義。臨床上RBP多采用適用于全自動生化分析儀的試劑盒進行檢測,但目前RBP檢測試劑盒大多為進口產品,價格昂貴,增加了檢測的成本,制約了臨床的推廣應用。因此,國產試劑盒的研制具有重要的臨床價值。本文在已有的研究背景下,綜合考慮經濟、操作等因素,開發(fā)出了一條新的RBP檢測試劑盒的研制路線,為RBP國產試劑盒的試生產奠定了基礎。
本文以腎衰患者的新鮮尿液為原
2、料,利用硫酸銨鹽析法對尿液中的RBP蛋白進行分離提取,得到RBP蛋白的粗提物。通過單因素實驗及正交試驗對不同的蛋白溶液飽和度、鹽析溫度、鹽析時間等條件進行優(yōu)化,得到RBP蛋白的最佳鹽析工藝條件,此時RBP蛋白的提取濃度達到2.46mg/mL。通過驗證實驗,證實該條件下RBP的提取量最高。
通過探索RBP蛋白粗提液的分離純化工藝路線,確定QSepharoseFastFlow柱層析和Superose12柱層析對RBP蛋白的純化
3、效果較好。利用單因素實驗和正交試驗研究不同實驗條件對純化效果的影響,得到兩步柱層析法的最佳工藝條件。純化后的蛋白溶液用全自動生化分析儀檢測RBP濃度,用Tricine-SDS-PAGE電泳檢測純度,確定得到的蛋白分子量為21kDa,是所要提取的RBP蛋白。此時RBP蛋白濃度為1.8mg/mL,純度為92%,計算得到產率為56%。
進一步采用純化得到的RBP抗原免疫綿羊,頸動脈放血提取抗血清,并研究不同免疫時間對抗血清效價的
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