刺糖多孢菌基因工程菌構建及多殺菌素生物合成研究.pdf

1、多殺菌素(Spinosad)是由刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)經有氧發(fā)酵產生的胞內次級代謝產物,屬新型大環(huán)內酯類抗生素。多殺菌素被認為是繼阿維菌素之后最為有效的生物殺蟲劑,成為新型生物農藥研發(fā)的熱點。然而,由于其發(fā)酵單位低、副產物多、產品收率低,導致生產成本高,制約了其工業(yè)化生產和全面推廣應用。因此,本研究通過代謝工程的方法對多殺菌素的合成途徑進行了改造,此外,還對多殺菌素合成過程中的一些關鍵問題作了研究

2、。主要研究結果如下:
　　1.本研究成功的建立了適合特定大小質粒的刺糖多孢菌的基因操作系統(tǒng)。本研究通過已建立的刺糖多孢菌操作系統(tǒng),成功的利用一種理性設計的手段,對多殺菌素合成途徑進行了改造。首先,為了使帶有鼠李糖糖苷配基的大環(huán)(R-AGL)更多的朝著PSA合成的方向進行,基因spnK在刺糖多孢菌中被過表達了。然后為了解決福樂糖胺合成量不夠的問題,參與福樂糖胺合成的六個基因(spnP,spnO,spnN,spnQ,spnR和spnS

3、)和spnK被共同表達,在這株基因工程菌中,使得積累的PSA轉化成了多殺菌素。為進一步提高多殺菌素的產量在基因工程菌LU104中過表達了gtt,gdh,kre,spnP,spnO,spnN,spnQ,spnR,spnS和spnK基因后,多殺菌素的產量達到了405mg/L,產量較野生菌株提高了5倍。
　　2.在本工作中,選擇了8個可能的參照基因(16SrRNA,GAPDH,tufA,hprT,rbL13,rpoB,ubQ和hrdB)

4、。用三個標準化算法(BestKeeper,geNorm和Normfinder)對這8個備選參照基因進行數(shù)據(jù)分析,結果顯示在不同刺糖多胞菌株和不同培養(yǎng)條件下,16SrRNA和rbL13的表達量均穩(wěn)定,為最佳參照基因。而在鏈霉菌中常用的GAPDH和rpoB基因則不適合作為刺糖多胞菌中RT-qPCR數(shù)據(jù)標準化的參照基因。
　　3.本研究在基因水平和代謝物水平從脂肪酸β氧化,脂肪酸從頭合成和多殺菌素合成的角度,解釋外源脂肪酸的添加可以提高