慶大霉素生物合成中抗性基因gmrA及抗性相關(guān)基因的研究.pdf

1、慶大霉素(Gentamicin)是重要的氨基糖苷類抗生素，早在二十世紀(jì)六十年代就從棘孢小單孢菌（Micromonospora echinospora）中被分離并鑒定。由于其在治療革蘭氏陰性菌引起的重度感染中展示出良好的臨床療效被沿用至今，而且近年來慶大霉素被不斷發(fā)現(xiàn)具有新的藥效活性，被認(rèn)為對(duì)于臨床治療上難以攻克的HIV病毒、結(jié)核桿菌等危及人類生命的疾病等具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　本研究旨在利用分子遺傳學(xué)的手段證明gmrA作為慶大霉素

2、產(chǎn)生菌中必須的抗性基因，并在此基礎(chǔ)上建立抗性測(cè)試快速篩選系統(tǒng)，進(jìn)一步探索產(chǎn)素菌合成基因簇上與抗性相關(guān)的其他基因，為探索氨基糖苷類抗生素的多重耐藥性的協(xié)同機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　首先，根據(jù)全基因簇序列，結(jié)合生物信息學(xué)分析，篩選出可能參與慶大霉素生物合成途徑中發(fā)揮抗性功能的候選基因gmrA。然后采用同框敲除的方法對(duì)抗性候選基因gmrA進(jìn)行同框缺失，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其雙交換突變株難以篩選，暗示gmrA很有可能是一個(gè)必須基因，發(fā)揮有關(guān)抗性的作用

3、。因此，通過構(gòu)建gmrA加倍的突變菌株，再對(duì)該菌株中的原位gmrA進(jìn)行同框缺失，篩選到了染色體加倍菌株中的gmrA原位敲除突變株，從而證明了gmrA是一個(gè)不可缺失的抗性基因。
　　其次，為了達(dá)到快速有效的篩選其它潛在的抗性基因的目的，本研究成功建立了一套基于大腸桿菌的慶大霉素抗性基因快速篩選系統(tǒng)，并進(jìn)一步測(cè)試了抗性候選基因gmrB、genP、genH、genI、genV。揭示了16s rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶GmrB輔助GmrA共同影響