逆轉座子激活對白念珠菌適應性形成的調控作用及其機制研究.pdf

1、白念珠菌是人類真菌感染主要的機會致病菌之一，目前許多潛在因素包括免疫抑制劑治療、抗生素治療、人類免疫缺陷病毒感染以及糖尿病等導致白念珠菌感染發(fā)病率升高，而白念珠菌本身對環(huán)境高度的高適應能力更加重真菌感染的形勢。逆轉座子（retrotransposons）是一種可移動基因片段，可經RNA介導發(fā)生自主轉座，廣泛存在于多細胞的真核生物中，對真核生物的基因組結構以及遺傳進化都具有重要的影響。近年來關于逆轉座子的轉座活性控制機制及其對宿主基因轉錄

2、表達影響的研究是當前國際上生命科學領域研究的熱點課題之一。本課題旨在發(fā)現白念珠菌中參與調控作用的逆轉座子，并初步探討逆轉座子產生轉錄轉座活性的可能機制，從遺傳進化的角度解釋白念珠菌中的逆轉座子激活與其高適應性形成的關系。
　　 實驗采用實時定量RT-PCR的方法，以白念珠菌SC5314為供試菌，考察參與損傷修復通路的基因在各種刺激條件下表達情況，并進一步比較白念珠菌基因組中逆轉座子蛋白編碼區(qū)ORFs的表達差異以尋找具有轉錄活性的

3、逆轉座子。大量文獻提示逆轉座子的激活與DNA損傷相關，因此首先選擇直接作用于DNA分子的致癌劑MMS刺激，可引起參與損傷修復的基因，特別是參與同源重組修復的基因表達升高，并且可引起除TCA8（orf19.6078 and orf19.6079）以外的多數逆轉座子ORFs發(fā)生程度不同的轉錄激活，提示白念珠菌中存在著有活性的逆轉座子。在此基礎上，我們深入地研究一些重要的環(huán)境刺激因素（高滲透、氧化刺激、唑類藥物）濃度達到半數致死劑量（IC50

4、）時對白念珠菌逆轉座子蛋白編碼區(qū)ORFs的轉錄表達影響。結果表明咪康唑（MCZ）和雙氧水（H2O2）刺激均可引起參與DNA損傷修復的基因廣泛地轉錄激活，并且在MCZ刺激6h時，TCA3 （ORF19.2219）、ZorrO2（ORF19.7274和ORF19.7275）以及TCA11（ORF19.6469）發(fā)生轉錄激活。H2O2刺激6 h時能選擇性地激活TCA8 （ORF19.6078和ORF19.6079）的轉錄活性，且在時間上修復基

5、因優(yōu)先于逆轉座子產生活性。但在高滲透刺激條件下，無論是NaCl還是sorbital高滲透刺激，均未發(fā)現有活性的逆轉座子，對損傷修復基因的表達影響無上調作用。由此推測環(huán)境對逆轉座子表達活性的調節(jié)具有選擇性，其轉錄激活與細胞的損傷修復密切相關。
　　 為進一步探討MCZ和H2O2刺激激活逆轉座子轉錄的機制，本課題在MCZ和H2O2刺激前給予抗氧化劑NAC，比較二者聯(lián)合作用對菌株的生長、逆轉座子、參與損傷修復基因的表達以及細胞內ROS

6、水平三方面的影響。研究表明NAC與MCZ刺激聯(lián)合時可抑制MCZ的殺菌作用，有效地保護酵母態(tài)細胞，而與H2O2聯(lián)用卻對菌株的生長情況無保護作用；NAC與二者聯(lián)合作用均可顯著地降低刺激所導致的損傷修復基因表達上調，并且刺激所激活的逆轉座子表達活性也會相應的減弱或消失；熒光檢測細胞內活性氧顯示NAC可有效地抑制MCZ、H2O2刺激所導致的細胞內ROS的產生積聚。提示MCZ和H2O2刺激后的ROS積聚使得細胞間接發(fā)生氧化損傷，同時啟動DNA損傷

7、修復通路，調控逆轉座子的表達。
　　 最后，我們采用southern blotting技術深入分析這些激活的逆轉座子是否能夠參與復制周期的所有過程，直至形成完整的雙鏈DNA分子，進一步評估轉錄活化的逆轉座子功能。實驗首先在液體培養(yǎng)基中長時間的環(huán)境加壓刺激誘導若干株菌，通過酶切后的基因組與特定標記的逆轉座子探針雜交顯色，發(fā)現MCZ誘導菌中Zorro2的拷貝片段明顯增加，而TCA3的拷貝片段反而減少；H2O2誘導菌也顯示可能發(fā)生TC