中華絨螯蟹腸道核心菌群初探.pdf

1、在中國，中華絨螯蟹是極受歡迎的美食，近幾年大閘蟹的人工養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年快速增長，成為水產(chǎn)經(jīng)濟養(yǎng)殖重要組成部分。但隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化的提高，抗生素不斷濫用，導(dǎo)致環(huán)境污染，病害加重，新的抗菌方法或者替代品急需被研制出來以減少抗生素的使用。
　　人和動物的體表和體內(nèi)含有數(shù)量龐大物種極多結(jié)構(gòu)復(fù)雜的微生物，這其中腸道細菌數(shù)量和種類又是最多的。目前研究發(fā)現(xiàn)，腸道細菌主要在消化吸收、免疫系統(tǒng)和新陳代謝等方面協(xié)助人體腸道發(fā)揮作用。水產(chǎn)動物的腸道中同樣

2、擁有復(fù)雜的微生物系統(tǒng)，針對魚類的腸道微生物研究較為充足，功能與人類腸道細菌相似。然而蝦蟹類腸道細菌的研究仍在初級階段，螃蟹的腸道細菌研究僅有三篇報道，優(yōu)勢菌屬于柔膜菌門(Tenericutes)，擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。但這些研究樣品量少，所得結(jié)果不能統(tǒng)一，核心菌屬難以確定，因此，對中華絨螯蟹腸道微生物的研究仍需更加深入。
　　如果能夠透徹研究腸道微生物的功能，就可以找到益生菌，從

3、而利用這些益生菌來幫助人或者動物更好得生存。目前，某些細菌，例如乳酸菌或雙歧桿菌等作為益生菌添加在人類的食品中，來促進人類的腸道或其他功能。而在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，枯草芽孢桿菌和梭菌屬等作為益生菌也已經(jīng)在飼料中應(yīng)用。但不同物種腸道結(jié)構(gòu)不同，腸道微生物也有所不同，應(yīng)用通用的益生菌制劑并不能完全發(fā)揮作用，因此能夠找到中華絨螯蟹腸道益生菌并將其利用在螃蟹養(yǎng)殖中去，對水產(chǎn)養(yǎng)殖是極大的貢獻。
　　本文旨在研究中華絨螯蟹腸道微生物多樣性從而找到核心菌

4、群，并檢測這些核心菌的來源，為后面學者研究腸道益生菌并應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中提供理論基礎(chǔ)。
　　本文通過現(xiàn)在流行的高通量測序以及DGGE測序技術(shù)來初步了解中華絨螯蟹腸道微生物的多樣性，而這些研究方法都是以PCR為基礎(chǔ)而建立的，因此合適的PCR引物，對結(jié)果的準確性有極大的影響。本文首先對應(yīng)用廣泛的細菌16S rRNA基因通用引物357F/518R的特異性進行驗證，發(fā)現(xiàn)其有非特異性擴增。經(jīng)進一步實驗分析發(fā)現(xiàn)V3區(qū)引物可以擴增多種動物的18S

5、 rRNA基因，而在現(xiàn)有的NCBI Genbank中也發(fā)現(xiàn)經(jīng)V3區(qū)引物擴增而得到到動物18S rRNA序列被誤認為細菌的16S rRNA序列而上傳。本文經(jīng)過Silicon分析以及實驗驗證，討論不同的細菌16S rRNA的特異性與覆蓋率，最終確定V1-V3區(qū)引物為特異性較好對細菌覆蓋率最高，適合應(yīng)用在DGGE上，而V1-V2區(qū)引物適合應(yīng)用在宏基因組擴增中。
　　應(yīng)用DGGE分析三只螃蟹的中后腸細菌，共得到17條不同條帶，經(jīng)割膠測序分

6、析這些序列屬于柔膜菌門(Tenericutes)，擬桿菌門(Bacteroidetes)，厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門(Proteobacteria)。而通過宏基因組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)柔膜菌門(Tenericutes)，擬桿菌門(Bacteroidetes)，變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)為腸道中優(yōu)勢門類，總量超過95％，而其他較少的門類主要是Actinobacteria，Chloro

7、flexi，Acidobacteria和Cyanobacteria。在屬水平上，這些門下主要有10種不同的優(yōu)勢OTU,分別是Bacteroides,Dysgonononas,Sunxiuqinia,CMCMollicutesgroup1,CMC Mollicutesgroup2,Vibrio,UnculturedStreptococcaceae,Pseudomonas,Pantoea和Coprobacillus。而這些菌在中華絨螯蟹的中

8、后腸都有存在，但分布有所不同。中華絨螯蟹腸道發(fā)現(xiàn)的Marinifilum fragile（屬于擬桿菌門）同在韓國海水底泥中發(fā)現(xiàn)的Marinifilum有很高的匹配度。中華絨螯蟹腸道發(fā)現(xiàn)的擬桿菌屬的細菌并未在其他動物腸道中發(fā)現(xiàn)相似性較高的細菌。這些擬桿菌屬可能是中華絨螯蟹腸道特有的細菌，并且和螃蟹腸道具有特殊的關(guān)系。這些擬桿菌在螃蟹后腸的分布比在中腸稍多，但不同的個體之間也有差別。
　　CMCMollicutesgroup1和CMC

9、Mollicutesgroup2可能是中華絨螯蟹腸道特有的常駐菌。CMCMollicutesgroup2和CandidatusBacilloplasma還有Candidatus Lumbricincola有較近的親緣關(guān)系，并且在中后腸中都有所發(fā)現(xiàn)。然而CMCMollicutesgroup1在中華絨螯蟹的中腸大量存在，這些細菌序列同在泥蟹(Scylla paramamosain)腸道中發(fā)現(xiàn)的uncultured Mycoplasmatac

10、eae序列有95%的匹配度，并且同在等足類海洋動物Ligia oceanica(Crustacea：Isopoda)的中腸中發(fā)現(xiàn)的共生菌uncultured Mycoplasmataceae的序列有超過96%的匹配度，因此CMCMollicutesgroup1可能與等足類動物中的Mycoplasmas起源于共同的祖先。而這兩株菌極有可能是在中華絨螯蟹腸道切片電鏡中發(fā)現(xiàn)分布具有柄基結(jié)構(gòu)和菌毛狀結(jié)構(gòu)細菌。
　　為了進一步驗證這些菌是否

11、為中華絨螯蟹腸道核心菌群，即是否能夠在不同養(yǎng)殖地點的螃蟹中都有存在，qPCR檢測了來自中國七個省市的9個不同養(yǎng)殖場的螃蟹腸道樣品。應(yīng)用設(shè)計的5類優(yōu)勢OTU特異性的引物所得拷貝數(shù)和細菌通用引物所得拷貝數(shù)的比例計算細菌在樣品中的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bacteroides，Sunxiuqinia,Mollicutesgroup1和Mollicutesgroup2能夠在多數(shù)樣品中檢測到，并且含量較高，為中華絨螯蟹腸道核心菌群。經(jīng)對螃蟹養(yǎng)殖水體和食物檢

12、測發(fā)現(xiàn)，Marinifilum來源是食物和水體，并不能長期存在于螃蟹的腸道中，不屬于核心菌群。而Sunxiuqinia可能來源于水體并在腸道中常駐，并且在所有樣品中有檢測到，含量較為穩(wěn)定，是優(yōu)勢的核心菌。而Bacteroides,Mollicutesgroup1和Mollicutesgroup2則是中華絨螯蟹腸道特有的微生物，在其他環(huán)境中未發(fā)現(xiàn)，有可能是由親代傳給后代，并非來源于環(huán)境。在qPCR分析時發(fā)現(xiàn)四種核心菌在后腸的含量都比中腸高